La reconnaissance du dommage

1.5.1.1.1 La réparation globale du génome (GG-NER)

L’étape de reconnaissance du dommage est une étape clé de la NER (Luijsterburg et al., 2010). Dans le cas de la GG-NER, la protéine XPC est le principal détecteur de lésion en reconnaissant les déstabilisations thermodynamiques de l’ADN (Sugasawa et al., 1998). XPC reconnait et lie la portion d’ADN simple brin (ssADN), causée par la rupture des liens intra-bases, sur le brin opposé au dommage (Min and Pavletich, 2007). Cette reconnaissance indirecte des dommages, permet à XPC de détecter une grande diversité de lésions ayant différentes structures (Puumalainen et al., 2016). La protéine XPC existe in vivo en complexe avec deux autres sous-unités : RAD23B qui stabilise XPC en le protégeant contre la dégradation par le protéasome et Centrin2 (CETN2) qui augmente l’affinité de XPC pour l’ADN (Figure 1.6) (Ng et al., 2003, Nishi et al., 2005). RAD23B aide XPC dans la reconnaissance de la lésion et est rapidement relâché une fois XPC associé à l’ADN endommagé (Bergink et al., 2012). Centrin2, contrairement à RAD23B, reste associée à XPC après la détection de la lésion. XPC contient différents domaines protéiques, dont le transglutaminase-like domaine (TGD) et trois épingles beta (beta hairping domain 1 à 3, BHD 1-3). Une des épingles beta de XPC, BHD3, est insérée dans le sillon d’ADN au site endommagé pour ouvrir et stabiliser le duplex, afin que les deux autres domaines BHD 1 et 2 puissent pincer le brin non endommagé et faire pivoter deux bases en dehors du duplex, formant ainsi la conformation ouverte (Min and Pavletich, 2007). L’hétérodimère XPC-CETN2 ainsi lié à l’ADN forme une plateforme de recrutement pour le facteur de transcription II humain (TFIIH) initiant ainsi les étapes subséquentes de la NER. Le mécanisme de recherche des dommages par XPC a été déterminé grâce à différentes études dont une étude de mutagénèse dirigée sur un court sous-domaine de XPC : β-turn situé entre les domaines BHD2 et BHD3. Cette étude a permis de démontrer que le motif β- turn est responsable de la répulsion de XPC par l’ADN et qu’il est essentiel à la bonne surveillance du génome en évitant que XPC ne reste trop longtemps sur un site d’ADN non endommagé (Camenisch et al., 2009). Une autre étude ayant démontrée que Rad4, l’homologue de XPC dans Saccharomyces cerevisiae, pouvait extruder des nucléotides non endommagés s’il était immobilisé assez longtemps sur de l’ADN natif. L’ouverture de l’ADN par Rad4 prend environ 7 millisecondes à un site de dommage, mais ce même processus

est de plusieurs ordres de grandeur plus long sur de l’ADN natif (Chen et al., 2015). Or Rad4 reste moins d’une milliseconde sur l’ADN non endommagé, ce qui rend peu probable son ouverture. Ces études suggèrent donc que la liaison de XPC et l’extrusion des nucléotides se font grâce au plus long temps de rétention de XPC sur l’ADN endommagé. Un tel mécanisme de déclenchement cinétique exclut l'ouverture de l'ADN natif tout en permettant l’ouverture sélective des sites endommagés présentant des brins complémentaires non liés (Puumalainen et al., 2016). XPC s’accote donc rapidement sur la double hélice pour vérifier l’intégrité de la complémentarité des brins et en cas de dommages se lie à l’ADN et forme la conformation ouverte.

Bien qu’elle soit le détecteur de nombreuses lésions dans l’ADN, la protéine XPC n’a que très peu d’affinité pour les dommages de types CPD, ceux-ci ne déstabilisant que faiblement la structure de la double hélice d’ADN (Sugasawa et al., 2001). Ce manque de spécificité de XPC pour les CPD est partiellement compensé par la protéine DDB2 (DNA damage- binding protein 2 ou XPE), qui présente une poche de liaison à haute affinité pour les CPD (Scrima et al., 2008). DDB2 et DDB1 (aussi connu comme XPE-binding factor) forment le complexe UV-DDB (Ultraviolet radiation–DNA damage-binding protein) dans lequel DDB2 se lie directement au dommage, tandis que DDB1 fait le lien entre DDB2 et un complexe CRL (cullin ring ligase) (Figure 1.6). Le complexe CRL4 est composé de CUL4A (cullin 4A) et de ROC1 (regulator of cullins 1) et a une activité E3 ubiquitin ligase (Groisman et al., 2003). La reconnaissance du dommage par DDB2 se fait via son domaine WD40. DDB2 insert alors son épingle beta dans le sillon mineur de l’ADN, ce qui permet d’extruder le dommage dans la poche de DDB2, formant ainsi un coude d’environ 40 degrés dans le duplex d’ADN. Cette déformation plus importante de l’ADN facilite le recrutement de XPC qui initie la GG-NER (Fitch et al., 2003). La haute affinité pour les lésions et la vérification de celles-ci dans sa poche de liaison permet à DDB2 de détecter des dommages réfractaires aux autres protéines de détection (Scrima et al., 2008). L’impact de DDB2 dans la détection des CPD est visible dans les cellules XPE -/- où l’absence de DDB2 diminue grandement l’excision des CPD alors que celle des 6-4PP n’est que minimalement réduite (Hwang et al., 1998, Moser et al., 2005, Tang et al., 2000). DDB2 n’est pas essentielle à la réparation NER, car XPC peut détecter les CPD même en son absence. DDB2 permet cependant d’accélérer grandement la reconnaissance de ces dommages (Fitch et al., 2003, Moser et al., 2005).

Une fois XPC au site de dommage, soit directement, soit via son recrutement par DDB2, la prochaine étape de la NER est initiée par le recrutement du facteur de transcription TFIIH par liaison protéine-protéine. Cette étape est commune à la TC-NER.

1.5.1.1.2 La réparation couplée à la transcription (TC-NER)

La TC-NER est directement couplée à l’élongation de la transcription (Sweder and Hanawalt, 1992). Elle est initiée par le blocage de l’ARN polymérase II (ARNPII) au site de dommage. Or l’ARNPII couvre environ 35 nucléotides sur le brin transcrit, ce qui empêche les protéines de la NER d’accéder au dommage (Tornaletti et al., 1999). Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer la libération du site de dommage par l’ARNPII, incluant sa dissociation de l’ADN, une translocation inverse (ou « backtracking »), sa dégradation ou le bypass de la lésion (Brueckner et al., 2007, Cheung and Cramer, 2011, Marietta and Brooks, 2007, Wilson et al., 2013). Le modèle de translocation inverse est cependant privilégié (Sigurdsson et al., 2010, Spivak, 2015). La coupure du transcrit en cours de synthèse est stimulée par le facteur d’élongation TFIIS en stimulant l’activité de coupure des ARN messager (ARNm) de l’ARNPII (Kettenberger et al., 2003). L’arrêt de l’ARNPII au site de lésion mène à sa stabilisation avec CSB (Cockayne Syndrome protein B), qui est considéré comme le coordinateur principal de la TC-NER (van den Boom et al., 2004), car il permet le recrutement de nombreux complexes et facteurs nécessaires aux étapes subséquentes de la NER (Sarker et al., 2005). CSB, fortement lié à l’ARNPII, induit un changement de conformation dans l’ADN (Beerens et al., 2005) et la liaison du complexe contenant UVSSA (UV-stimulated scaffold protein A) et USP7 (ubiquitin-specific protease 7) à l’ARNPII, ce qui stabilise CSB et le protège de la dégradation (Schwertman et al., 2012). CSB active également le recrutement d’un autre complexe, CRL4CSA_{, contenant les protéines DDB1,}

CUL4, ROC1 et CSA (Cockayne Syndrome protein A). Ce complexe a une activité E3 ubiquitine ligase similaire à celui lié à DDB2 (Groisman et al., 2003). CRL4CSA _{orchestre les}

évènements de remodelage de la chromatine médiés par p300 et HMGN1 (High-mobility group nucleosome-binding protein 1), et permet le recrutement de XAB2 (XPA-binding protein), protéine indispensable à la TC-NER, qui est impliquée dans la restauration de la synthèse de l’ARN (Kuraoka et al., 2008, Nakatsu et al., 2000). Finalement, c’est le recrutement par CSB du facteur TFIIH qui permet l’initiation de l’étape suivante de la NER.