2 Chapitre : Matériels et Techniques
2.3 Techniques expérimentales
2.3.3 Technique de caractérisation physico-chimique de surface
a) Caractères hydrophile/hydrophobe et acide/base de Lewis des microorganismes Ces propriétés de surface sont déterminées à l’aide du test MATS (Microbial Adhesion To Solvents).
¾ Principe
La MATS est une méthode de partage développée par Bellon-Fontaine et al qui permet de déterminer le caractère électron-accepteur/électron-donneur (acide/base au sens de Lewis) et le caractère hydrophile/hydrophobe des microorganismes [221]. Elle est basée sur l’étude de l’affinité des microorganismes pour 4 solvants de propriétés physico-chimiques différentes et connues (tableau 5). Le chloroforme CHCl3 (noté C) est un solvant polaire acide au sens de Lewis ; l’acétate d’éthyle (noté AE) est un solvant polaire basique au sens de Lewis ; l’hexadécane (noté HD) et le décane (noté D) sont deux solvants apolaires. Il est à noter que la composante de Lifshitz-Van der Waals de l’énergie de surface est à peu près égale pour le chloroforme et l’hexadécane d’une part, pour le décane et l’acétate d’éthyle d’autre part.
γLLW γL+ γL
-Chloroforme (C) 27,2 3,8 0
Hexadécane (H) 27,7 0 0
Décane (D) 23,9 0 0
Acétate d’éthyle (AE) 23,3 0 19,4
Tableau 5 : caractéristiques énergétiques des solvants utilisés pour la MATS en mJ.m-2
(γLLW est la composante due aux interactions de Lifshitz-Van der Waals, γL+ la composante électron-accepteur et γL- la composante électron-donneur)
Le caractère base de Lewis (électron-donneur) du microorganisme est déterminé par la comparaison des affinités avec le chloroforme et l’hexadécane.
Le caractère acide de Lewis (électron-accepteur) du microorganisme est déterminé par la comparaison des affinités avec l’acétate d’éthyle et le décane.
Le caractère hydrophile/hydrophobe du microorganisme est déterminé par son affinité pour le décane et l’hexadécane.
Afin de s’affranchir des interactions électrostatiques entre microorganismes et solvants, les cellules sont généralement placées dans un liquide de force ionique élevée, telle que l’eau physiologique (9 g/L NaCl). Dans ce travail, la MATS a été effectuée en eau physiologique et dans le milieu étudié, l’eau de rivière artificielle (0,3 g/L NaCl).
¾ Protocole expérimental
Dans un tube à hémolyse sont introduits 2,4 mL de la suspension microbienne à analyser et 0,4 mL de solvant. L’échantillon est agité fortement par vortexage durant deux minutes, afin de former une émulsion entre la phase aqueuse et la phase organique. L’émulsion est ensuite laissée au repos pendant 15 minutes, afin que les deux phases décantent. La mesure de la densité optique initiale de la suspension (DOi) et de la densité optique finale de la phase aqueuse (DOf) permet de calculer le pourcentage d’affinité de la suspension pour le solvant :
100 X ) DO DO 1 ( (%) Affinité i f − = (40)
La figure 22 propose un schéma du protocole expérimental.
Suspension microbienne solvant agitation Décantation émulsion DOi DOf
Figure 22 : schéma du protocole expérimental de la MATS [199]
b) Mobilité électrophorétique et charge globale de surface des microorganismes ¾ Principe de la mesure
Les cellules microbiennes sont assimilées à des particules colloïdales en suspension. Lorsque des particules chargées sont soumises à l’action d’un champ électriqueEr
, elles se déplacent à une vitessevr. Le mouvement des particules chargées est schématisé sur la figure 23.
a- Charge de surface positive b- Charge de surface négative
Figure 23 : action d’un champ électrique sur des particules possédant une charge de surface
La mobilité électrophorétique des particules, notée ME, est définie par la relation (41) :
E v
ME= (41)
Différents modèles permettent de relier la mobilité électrophorétique au potentiel électrocinétique ou potentiel zêta ζ des particules. Dans ce travail, l’équation de Smoluchowski (42) a été utilisée. ME . 4 ε η π = ζ (42)
où η est la viscosité dynamique du milieu et ε sa permittivité.
La mesure de la mobilité électrophorétique permet de déterminer le potentiel zêta des cellules microbiennes.
¾ Protocole expérimental
Les cellules microbiennes sont mises en suspension en eau de rivière artificielle, dont la faible conductivité ne « masque » pas la charge de surface des cellules. La concentration est ajustée à 106 cellules/mL environ, puis la suspension est injectée dans une cellule d’acquisition. Une tension de 50 V est appliquée entre deux électrodes pour générer un champ électrique dans le canal. Les particules sont éclairées par un faisceau laser et leur vitesse de déplacement est mesurée à l’aide d’une chaîne d’acquisition numérique (figure 24).
La mobilité électrophorétique des particules est mesurée à différentes valeurs de pH de la suspension, afin de déterminer le point isoélectrique du microorganisme, c’est-à-dire la valeur
Er
vr
vr
Er
vr
vr
de pH annulant sa charge de surface. Le pH est ajusté par des ajouts de KOH ou de HNO3
dans une gamme allant généralement de 2 à 8.
L’appareillage utilisé consiste en un zêtamètre laser (Zetaphoromètre II, CAD Instrumentation, Les Essarts-le-Roi, France) couplé à un microscope (BX, Olympus, France).
Entrée du liquide Laser Microscope Caméra Sortie du liquide Ordinateur
a- Schéma du montage expérimental b- Photographie du montage expérimental
Figure 24 : montage expérimental utilisé pour les mesures
de mobilité électrophorétique de cellules microbiennes
2.3.3.2 Caractérisation physico-chimique de la surface des supports en acier inoxydable
a) Caractérisation de l’énergie de surface des matériaux ¾ Principe
Les caractéristiques énergétiques de surface AB
S S S LW
S ,γ ,γ etγ
γ + − des supports solides sont
obtenues à partir de mesures d’angles de contact θ (réalisées par la méthode de la goutte posée) et de la relation de Young-Van Oss : [201]
) cos 1 ( ( 2 γSLWγLLW + γS+γL− + γS−γL+ =γL + ϑ (43)
Pour rappel, le terme γSAB lié aux interactions acide/base au sens de Lewis peut s’exprimer en fonction de γS+ et γS- selon l’équation :
− +γ γ =
γAB 2 (44)
L’énergie de surface du solide γS est la somme du terme lié aux interactions de Lifschitz-Van der Waals et du terme acido-basique :
AB LW+γ γ =
γ (45)
L’équation (43) à trois inconnues peut être résolue en effectuant des mesures d’angles de contact avec trois liquides purs de propriétés connues sur les supports plans en acier inoxydable. Dans cette étude, les trois liquides utilisés sont l’eau, le diiodométhane et le formamide, dont les caractéristiques énergétiques sont indiquées dans le tableau 6.
Liquide Formule γLW γ- γ+ γAB γ
Eau H2O 21,8 25,5 25,5 51 72,8
Diiodométhane CH2I2 39 39,6 2,3 19,09 58,1
Formamide CH3NO 50,8 0 0 0 50,8
Tableau 6 : caractéristiques énergétiques (en mJ.m-2) de liquides utilisés pour les mesures d’angles de contact
[221, 222]
Le système à 3 équations (mesures pour trois liquides différents) et à 3 inconnues (γSLW, γS-, γS+) permet de calculer les caractéristiques énergétiques de surface des échantillons.
Les mesures d’angles de contact sont réalisées par la méthode de la goutte posée. ¾ Protocole expérimental
Une goutte de liquide L est déposée sur une surface solide S créant ainsi un système à trois phases (solide, liquide, air). L’angle formé entre la surface du solide et la tangente à la surface du liquide au point triple est appelé θ et mesuré à l’aide d’un goniomètre Krüss G10 (figure 25).
a- Angle de contact b- Goniomètre G10 (Krüss, Palaiseau, France)
Figure 25 : représentation de l’angle de contact au point triple (liquide, solide, air) et
goniomètre utilisé dans cette étude
b) Potentiel électrocinétique des aciers inoxydables
Le potentiel électrocinétique (ou potentiel d’écoulement) de la surface plane des supports est estimé par des mesures de potentiel zêta.
¾ Principe
Dans une cellule de mesure sont disposées parallèlement deux plaques planes du matériau à caractériser. L’espace entre les plaques constitue un fin capillaire dans lequel une solution est mise en mouvement. La différence de potentiel E est mesurée aux bornes de la cellule ainsi que la perte de charge P. La conductivité de la solution est mesurée par un capteur situé sur le circuit d’écoulement de l’électrolyte. Le potentiel E est appelé potentiel d’écoulement ou potentiel électrocinétique [207].
Lorsqu’un électrolyte circule entre deux plaques métalliques portant une certaine charge, les particules se répartissent d’une certaine manière au voisinage des plaques : les contre-ions adsorbés à la surface et l’eau structurée par le champ de surface forment la couche de Stern, et, plus éloignée, la zone non influencée par la surface est appelée couche diffuse. La circulation du liquide entraîne l’apparition d’une différence de potentiel entre la couche de Stern fixe et la couche diffuse circulante, au niveau de leur interface appelée plan de coupure hydrodynamique. Cette différence de potentiel est appelée potentiel zêta ζ [205].
Le calcul montre que la perte de charge et le champ électrique dans le capillaire sont liés. L’égalisation du courant de convection (dû à la circulation de la couche diffuse) et du courant de conduction (liquide conducteur) permet d’établir la relation de Helmholtz-Smoluchowski (46), dans le cas où le régime d’écoulement est laminaire.
S
θ L air
(46)
ζ
4ππη
ε
P
E =
où E est la différence de potentiel et P la différence de pression aux bornes du capillaire, ε la constante de permittivité diélectrique du liquide, η sa viscosité dynamique et λ sa conductivité électrique.
Le potentiel zêta dépend de la conductivité, de la température et de la permittivité électrique du milieu. Il est calculé grâce à l’équation (47) :
)
47
(
λ
C
55
,
13
10000
P
E
ζ = ⋅ ⋅ ⋅ ⋅
où E est en mV, P en mbar et λ en S.cm-1. C est une constante qui dépend de la température T, suivant la loi empirique :
)
48
(
T
00351
,
0
T
35197
,
0
32
,
16
C = − +
2 ¾ Protocole expérimentalDeux plaques d’acier inoxydable d’épaisseur 1 mm sont introduites dans la cellule de mesure. Le capillaire ainsi formé a une épaisseur de 150 µm.
La différence de pression et la différence de potentiel entre les deux extrémités de la cellule sont mesurées pour des débits d’entrée du liquide différents. L’appareillage utilisé est un zêtamètre ZetaCAD (CAD Instrumentation, Les Essarts-le-Roi, France). La courbe tracée par le logiciel d’acquisition/traitement ZetaCAD4 reporte E/P en fonction de P ; une régression linéaire effectuée automatiquement calcule la valeur la pente. Les valeurs de la température et de la conductivité sont implémentées dans le calcul, qui donne alors la valeur du potentiel zêta des échantillons.
2.3.4 Estimation de la biocontamination d’une surface en conditions