Tailles et masses moléculaires des protéines extraites du tourteau de tournesol

Avant de chercher à savoir si la fraction protéique a un rôle prépondérant dans la matrice thermoplastique du composite tourteau de tournesol, il convient de définir les distributions de tailles et de masses des protéines de ce dernier. Pour ce faire, nous avons utilisé deux techniques analytiques distinctes : l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12% en condition dénaturante (contenant du sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE), qui nous a permis d’étudier la distribution de tailles de la fraction protéique de masses moléculaires modérées ; et le fractionnement par flux croisé (AFFFF) muni d’un réfractomètre (RI) et d’un détecteur laser multiangulaire (MALLS), qui nous a permis d’analyser deux populations protéiques de masses moléculaires de gammes différentes (< 300kDa et ≥ 300kDa).

2.3.1.3.1 Résultats d’électrophorèse

Les extraits protéiques de TB3 obtenus par extraction au tampon phosphate pH 6,9 contenant ou non du SDS ont été analysés en condition réductrice et non réductrice, c’est-à- dire en présence ou absence de β-mercaptoethanol (2-ME) dans le tampon de charge. Les résultats sont présentés sur la Figure 2.6. Ils ont été étudiés en analyse d’image par le logiciel Alpha Imager.

Les marqueurs, M (situés sue la colonne de gauche pour les gels présentés Figure 2.6), contiennent des protéines dont les masses moléculaires connues sont les suivantes (en kDa) : 205 ; 116 ; 97 ; 84 ; 66 ; 55 ; 45 ; 36 ; 29 ; 24 ; 20 ; 14,2 ; 6,5.

Sans SDS dans le tampon d’extraction

2% SDS dans le tampon d’extraction Marqueurs

(kDa)

Sans 2-ME Avec 2-ME Sans 2-ME Avec 2-ME

205 116 97 84 66 55 45 36 29 24 20 14,5 6,5

Figure 2.6 : Gels d’électrophorèse SDS-PAGE (12%) d’extraits protéiques de tourteau de tournesol TB3 : tampon d’extraction phosphate pH 6,9 (marqueurs protéiques M sur les colonnes de gauche).

Le SDS contenu dans le tampon d’extraction permet d’extraire plus de polypeptides de taille à la fois moyenne (80kDa) et de petite taille (15-17kDa) pour les extraits protéiques de TB3. La présence de mercaptoéthanol induit la disparition de bandes de protéines de tailles moyennes et grosses, et l’apparition et l’accentuation de bandes de masse moléculaire plus petite (Tableau 2.7).

Sans SDS dans le tampon d’extraction

2% SDS dans le tampon d’extraction

Sans 2-ME Avec 2-ME Sans 2-ME Avec 2-ME

+ 57-66 15-20 57-68 15-17 50 35-40 52 35-40 45 25 48 10-12 40 < 10 80 < 8 35 30 15-17 26-30 < 8 12 10 30-66 32 60 115 80 32-40 Intensité d es bandes - < 8

Tableau 2.7 : Relevés des masses moléculaires (valeurs données en kDa) et des intensités des bandes correspondant aux protéines extraites de TB3 par tampon phosphate pH 6,9 ajouté ou non de SDS.

A partir de travaux réalisés depuis les années 1970 sur les protéines de tournesol (Sabir, 1973; Schwenke, 1978; Dalgalarrondo, 1984; Ferjani, 1987; Kortt, 1990; Raymond, 1991; Sammour, 1995; Molina, 2004), nous allons tenter d’identifier les protéines extraites de TB3.

Des protéines de tournesol de masses moléculaires importantes ont été mises en évidence par divers auteurs : 15S de masse moléculaire 600kDa correspondant à l’agrégation de polypeptides acides α et basiques β selon ([αβ]6)n ; 11S à 300-350kDa, [αβ]6 ; 7S à 150-

190kDa, [αβ]3 (Sabir, 1973; Schwenke, 1978; Ferjani, 1987; Molina, 2004). Notons que

Dalgalarrondo a mis en évidence trois fractions de globulines : l’une à 450kDa ; la seconde à 300-350kDa, 11S ; et la dernière à 190kDa, 7S. Puisque nous avons choisi d’analyser nos extraits protéiques avec des gels de polyacrylamide en présence de SDS, ces agrégats protéiques cités précédemment seront nécessairement dissociés. Afin d’observer d’éventuels agrégats protéiques, nous aurions pu effectuer des électrophorèses sur gel neutre.

La dissociation de la forme 7S de l’hélianthinine (190kDa) présente une bande supplémentaire à 57kDa par rapport à la dissociation des deux autres fractions (15S et 11S) dont les bandes sont en kDa : 62 ; 60 ; 54 ; 52 ; 48 ; 46 ; 40 ; 39 (Dalgalarrondo, 1984). Ces polypeptides correspondraient à des dimères [αβ], de coefficient de sédimentation 2-3S, et dont les sous-unités sont liées par ponts disulfures (Dalgalarrondo, 1984; Molina, 2004). Ces dimères peuvent se dissocier en présence de 2-ME en divers polypeptides α et β en une ou plusieurs étapes (électrophorèse multidimensionnelle). Les polypeptides α présentent des masses moléculaires suivantes en kDa : 44 ; 42 ; 41 ; 23-27. Les masses moléculaires 36kDa, 34kDa, 33kDa ; 25-27kDa correspondent aux polypeptides β des globulines de tournesol (Dalgalarrondo, 1984; Molina, 2004).

Toutefois, nos extraits sont susceptibles de contenir d’autres protéines que des globulines. En effet, des protéines de masses moléculaires 28kDa et 10-18kDa correspondraient aux albumines de tournesol (Kortt, 1990). De même, des protéines membranaires des vacuoles lipidiques pourraient être extraites du tourteau de tournesol, leurs masses moléculaires seraient alors comprises entre 19 et 21kDa (Raymond, 1991; Sammour, 1995).

Les dimères [αβ] sont majoritaires dans les extraits protéiques de TB3, ainsi que quelques globulines 7S (Mw > 60kDa). Puis, quelques polypeptides acides et basiques sont identifiables

ainsi que de rares protéines de masse moléculaire plus importante mais non identifiables à partir de la littérature (80, 115 et 120kDa). Il s’agit peut-être d’agrégats protéiques, qui ont pu se former lors de la trituration des graines de tournesol. Il pourrait s’agir d’agrégats

d’albumines puisqu’en présence de 2-ME dans le tampon de charge, de petites protéines de même taille que les albumines de tournesol apparaissent.

En présence de SDS, quelques autres protéines sont extraites de TB3 : il s’agirait principalement d’albumines.

2.3.1.3.2 Résultats d’AFFFF-MALLS

L’analyse dite AFFFF-MALLS consiste en un fractionnement d’un échantillon, extrait protéique dans notre étude, suivi de mesures quantitatives par un détecteur réfractométrique (RI), et de mesures qualitatives par un détecteur multi-angulaire laser (MALLS). Le principe de cette analyse et la théorie de la méthode sont exposés en partie expérimentale (§ 6.2.3).

Des premiers essais ont permis de déterminer l’éluant adéquat pour fractionner les extraits protéiques, obtenus selon le protocole mis au point précédemment (§ 2.3.1.2). Il s’agit d’une solution tampon de phosphate de sodium à 10mM, de pH 6,9 et contenant 0,1% de SDS. L’indice de réfraction de cet éluant a été déterminé, sa valeur est de 1,358.

Des fractogrammes préliminaires ont également permis de mettre au point non pas une méthode d’analyse, mais deux méthodes distinctes qui correspondent à deux espaceurs de cellule d’épaisseur différente. Le premier de 490µm permet d’analyser des protéines de taille relativement petites, de l’ordre de 10 à 300kDa. Le second espaceur de 250µm permet d’accéder à des informations concernant une population de protéines de très grande masse moléculaire, de 300kDa à 650MDa. En effet, le temps de rétention est également proportionnel à l’épaisseur de la cellule de fractionnement (w). Le détail des méthodes utilisées est présenté en Partie Expérimentale (§ 6.2.3). Dans les deux cas, l’étalonnage a été effectué à l’aide d’une solution de sérum albumine bovine (BSA) de concentration connue, à diffusion isotropique : son rayon de giration est de 3nm, et son temps de rétention de 18min, soit 10min à partir du début de l’élution en flux linéaire (méthode 490).

La Figure 2.7 présente les fractogrammes obtenus par l’analyse des deux extraits protéiques obtenus à partir du tourteau de tournesol brut mis en présence de tampon phosphate pH 6,9 en absence ou présence de 2% de SDS. Dans le cas des protéines de masse moléculaire inférieure à 300kDa, les résultats sont étudiés pour des temps de rétention de 12,5 à 30min, alors que dans le cas des protéines de masse moléculaire supérieure à 300kDa, ils sont étudiés pour des temps de rétention de 10 à 28min.

A) Sans SDS