SYNTHESE DU COMPOSE 55

Une séquence réactionnelle identique a été envisagée pour aboutir au composé 55, analogue du lead ICF05016 possédant un espaceur triazolé (Figure 127).

Figure 127: Voie de synthèse du composé 55, équivalent du lead ICF05016

La première étape a été similaire à celle mise en œuvre pour obtenir le lead ICF05016, moyennant l’utilisation de propargylamine à la place de la N,N-diméthylaminopropylamine. Le

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produit de couplage 53 a été isolé avec un rendement de 66 % à l’issu d’une colonne chromatographique, puis a été engagé dans une réaction de chimie click avec l’azoture 50 dans les mêmes conditions que pour le composé 51. Toutefois, la purification par chromatographie sur gel de silice s’est avérée difficile et a dû être complétée par une chromatographie préparative en phase inverse (colonne C18, gradient d’ACN dans H2O), qui a permis d’obtenir après lyophilisation le

triazole 54 avec une pureté de 90% d’après l’analyse RMN 31_{P. La caractérisation complète de la}

structure a été faite par les analyses RMN 31_P, 1_H, 13_{C appuyées par des expériences COSY et HSQC.}

Comme pour son analogue 51, la formation du triazole est mise en évidence par un singulet dans la zone aromatique à 7,8 ppm et par les signaux relatifs aux carbones aromatiques (CAr à ~ 148,06

ppm et CHAr à ~124,11 ppm).

Enfin, la quaternisation de cette fraction a été réalisée selon les conditions précédemment décrites pour la quaternisation du composé 51. L’analyse RMN du brut réactionnel a confirmé l’obtention de la prodrogue AQ 55, mais avec une pureté de seulement 90%, qui nécessitera une purification supplémentaire en phase inverse (colonne C18, gradient d’ACN dans H2O) avant la

réalisation des tests biologiques.

En conclusion, les deux produits souhaités analogues triazolés du hit et de son isomère de position ont pu être synthétisés. Ils feront l’objet prochainement d’un screening biologique préliminaire en vue de pouvoir conclure sur l’impact de la présence du motif triazole au niveau du bras espaceur sur l’interaction avec l’aggrécane et l’activité cytotoxique.

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Les stratégies de "targeted drug delivery" basées sur l'utilisation d'un vecteur établissant une liaison préférentielle avec une ou plusieurs cibles biologiques représentent de nos jours un champ de chimie médicinale en plein essor, notamment en oncologie. Plusieurs molécules fruits de cette approche ont été mises sur le marché du médicament, offrant à de nombreux patients souffrant de pathologies cancéreuses de nouvelles opportunités de thérapies efficaces et sélectives. Ce ciblage peut concerner des caractéristiques propres aux cellules néoplasiques mais également au microenvironnement tumoral. Concernant ce dernier point, nous pouvons citer l’inflammation, le système immun, l’angiogenèse ou l’hypoxie, commun aux tumeurs solides et mis à profit depuis de nombreuses années pour le design de traitements ciblés.

Mes travaux de thèse se sont inscrits dans ce cadre, mais plus particulièrement pour le cancer du cartilage, et ont été articulés autour de la pharmacomodulation d’un composé « lead »

ICF05016, déjà identifié dans le laboratoire IMoST. Grâce à la combinaison au sein de cette même

structure d’une approche de vectorisation d’un agent cytotoxique alkylant vers les protéoglycanes de la matrice extracellulaire du chondrosarcome (par une fonction ammonium quaternaire) et d’une bioactivation sélective en milieu hypoxique tumoral, cette prodrogue bispécifique s’est révélée prometteuse en termes d’affinité pour l’aggrécane, de sélectivité d’action en milieu hypoxique, et de réponse antitumorale in vivo.

Comme axes de pharmacomodulation, nous nous sommes dans un premier temps intéressés à faire varier la nature des substituants de la fonction ammonium quaternaire ainsi que la longueur du bras espaceur séparant cette dernière de la prodrogue, puis nous avons choisi de moduler l’halogène et la position des bras alkylants portés par la moutarde phosphorodiamidique.

Concernant le 1er _{axe de pharmacomodulation (longueur du bras espaceur et nature des}

substituants), nos efforts de recherche se sont avérés concluants : une série de 27 composés ammonium quaternaires ont pu être synthétisés, isolés purs et étudiés in tubo, d’abord par résonance plasmonique de surface pour évaluer leurs affinités pour l’aggrécane puis in vitro par une étude de la cytotoxicité en normoxie versus hypoxie sur une lignée cellulaire de chondrosarcome humain, HEMC-SS.

Dans un premier temps, le screening par résonance plasmonique de surface a permis de mettre en évidence 12 composés plus affins envers l’aggrécane que le composé de référence

ICF05016. Cette étude a révélé une dépendance importante entre l’affinité à l’aggrécane et la

nature de l’ammonium quaternaire. En effet, la reconnaissance ligand-aggrécane semble potentialisée par des substituants de l’ammonium quaternaire de type benzyle et au contraire réduite par des substituants aliphatiques encombrés, de type diisopropyle.

Dans un second temps, ces composés sélectionnés sur la base de leur affinité pour l’aggrécane ont été évalués sur cultures cellulaires et ont affichés des ratios de cytotoxicité normoxie vs hypoxie (HCR) supérieurs à celui du lead ICF05016, confirmant ainsi leur appartenance à la classe des prodrogues activables en hypoxie. Les structures porteuses d’une fonction ammonium quaternaire benzylique se sont avérées les plus puissantes en termes de sélectivité

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d’action, le meilleur ratio HCR étant obtenu avec le composé 31f (HCR = 24, soit sensiblement identique à celui de l’évofofamide et trois fois supérieur à celui du lead ICF05016). Outre son excellente stabilité sur 24 heures dans un tampon phosphate et dans le plasma à 37 °C, le composé

31f s’est révélé être bioréduit par une nitroréductase, et ce avec une cinétique de clivage rapide

(demi-vie < 1 min). Ce dernier a été ainsi identifié au terme de l’évaluation in vitro et de cet axe de recherche comme un nouveau « lead ».

Ces éléments ouvrent donc de nouvelles perspectives à ce projet, notamment les résultats prometteurs obtenus pour le composé 31f devront être confirmés in vivo sur modèle animal de chondrosarcome. Cette étude permettra d’estimer son efficacité antitumorale et son profil de tolérance (notamment de toxicité hématologique) et pourrait s’accompagner d’une étude pharmacocinétique (distribution, métabolisme et élimination).

Concernant le 2nd _{axe de pharmacomodulation, relatif aux analogues bromés, les}

prodrogues amines IIIaires _{non vectorisées 35a-b ont pu être obtenues, mais les différentes}

tentatives de quaternisation entreprises en vue d’aboutir aux produits ammoniums quaternaires finaux 36a-b et 37 se sont heurtées à des soucis de stabilité. En effet les analogues bromés des composés ICF05016 et 31f n’ont pu être obtenus avec une pureté suffisante pour être engagés dans une évaluation biologique. Compte-tenu de la forte instabilité des composés finaux de la série bromée, comparée à la série chlorée, il semble peu judicieux de poursuivre dans cette voie.

Le dernier axe envisagé dans cette étude portait sur la préparation d’isomères de position de l’entité cytotoxique. Quatre voies d’accès aux structures souhaitées ont été envisagées, dont certaines ont été d’emblée écartées anticipant des soucis très vraisemblables de réactivité. Pour d’autres, les essais menés se sont montrés infructueux, notamment en raison de l’instabilité des précurseurs phosphoramidiques (probablement en lien avec la présence de la fonction amine tertiaire) ou encore de la difficulté d’introduction d’une fonction amine secondaire sur un chlorure de phosphoryle préalablement fonctionnalisé.

Afin de contourner ces différents obstacles, nous avons choisi de réorienter notre stratégie de synthèse vers une approche de « chimie click » permettant d’introduire le bras espaceur porteur de la fonction amine tertiaire indépendamment de l’étape de phosphorylation. Une séquence réactionnelle multi-étapes a alors été mise en œuvre et a permis d’isoler les deux composés souhaités 52 et 55, analogues du composé ICF05016 et de son isomère de position.

Ces deux prodrogues doivent maintenant être évaluées pour leur affinité à l’aggrécane et leur cytotoxicité in vitro en hypoxie et normoxie en vue d’appréhender d’une part l’impact de la présence du noyau triazole sur ces paramètres, et d’autre part l’influence de la position des bras 2-chloroéthyle sur l’efficacité de la moutarde. Au regard de ces résultats, il pourrait être envisagé de synthétiser l’équivalent triazolé du nouveau « lead » 31f ou de son isomère de position.

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1. GENERAL INFORMATION

All commercially available reagents and solvents were purchased at the following commercial suppliers: Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France), Acros Organics (Geel, Belgium), Fisher Scientific (Illkirch, France), Carlo Erba Reagents (Val de Reuil, France), VWR (Fontenay-sous-Bois, France) and Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) and were used without further purification. All solvents were dried using common techniques. Air and moisture sensitive reactions were carried out under anhydrous argon atmosphere. Analytical thin-layer chromatography (TLC) was performed on precoated silica gel aluminium plates (60 F254, 0.2 mm thick, Macherey or SDS) using

the indicated solvent mixture expressed as volume/volume ratios. The plates were visualized with ultraviolet light (254 nm) and (or) by development with ninhydrine ethanolic solution (0.2%) or a 4-(4'-nitrobenzyl)pyridine (NBP)/potassium hydroxide dyeing reagent used for the determination of alkylating agents (the chromatography plate was immersed in the NBP solution (2.5% in acetone), heated for few min and then immersed in potassium hydroxide solution (10% in methanol)). Column chromatography was performed on silica gel 60A normal phase, 35-70 μm (Merck or SDS or Carlo Erba). Uncorrected melting points (mp) were measured on an electrothermal capillary Digital Melting Point Apparatus (IA9100, Bibby Scientific, Roissy, France). Infrared spectra (IR) were recorded in the range 4000-600 cm−1 _{on a IS10 with attenuated total}

reflectance (ATR) accessory Nicolet (Fisher Scientific). Nuclear magnetic resonance spectra (1H NMR and 13C NMR) were performed on a Bruker AM 200 spectrometer (200 MHz for 1H, 50 MHz for 13_{C), a Broker Avance DPX300 spectrometer (300 MHz for 1H, 75 MHz for} 13_{C) or a Bruker DRX}

500 spectrometer (500 MHz for 1_{H, 125 MHz for} 13_{C) (Bruker Biospin SAS, Wissembourg, France).}

Chemical shift values (δ) are quoted in parts per million (ppm) and calibrated to the deuterated solvent reference peak for 1_{H and} 13_{C spectra.} 31_{P NMR spectra (202 MHz) were recorded on a}

Bruker Avance 500 apparatus with broadband 1_{H decoupling and chemical shifts were reported}

relative to a 1% phosphoric acid solution in deuterium oxide as a coaxial reference (0 ppm). Coupling constants (J) are quoted in Hz. To describe spin multiplicity, standard abbreviations such as s, d, dd, t, q, qt, hept, td, m, br.s referring to singlet, doublet, doublet of doublet, triplet, quartet, quintet, heptuplet, doublet of triplet, multiplet, broad singlet respectively, are used. When necessary, chemical shifts assignments in 1_{H and} 13_{C spectra were supported by two dimensional}

NMR experiments (COSY and HSQC). Compounds were analyzed by High-Resolution Mass Spectrometry in positive mode (HRMS, Waters® Micromass® Q-Tof micro™ Mass Spectrometer, UCA-Partner, Clermont Auvergne University, Clermont-Ferrand, France). Preparative high performance liquid chromatography was performed on a CombiflashEZprep (Teledyne ISCO). The purification of QA-derivatives was carried out on a C18 column using the following conditions: total

experiment time: 30 min, flow rate = 15 mL/min, eluent mixture: H2O/MeCN (v/v), gradient: 95/5

for 2 min, then 95/5 → 70/30 for 6 min, then 70/30 for 2 min, then 70/30 → 60/40 for 6 min, then 60/40 for 3 min, and 60/40 min → 10/90 for 11 min, λ = 254 and 323 nm.

Abbreviations: ACN, acetonitrile; DCM, dichloromethane; NBP, 4-(4'-nitrobenzyl)pyridine; TEA, triethylamine; THF, tetrahydrofuran; rt, room temperature.

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