R. solanacearum, il est recommandé d ’effectuer un test de pouvoir pathogène (Janse, 1988; OEPP/EPPO, 1990) ou une PCR (Caruso et al., 1998) pour confirmer un résultat p o sitif en immunofluorescence. 11 s ’agit d ’une technique très utilisée pour la sélection sanitaire vis-à-vis de nombreuses bactérioses affectant semences, tubercules et boutures (Schaad et al., 1990).
1.3.7. Les méthodes basées sur les propriétés des acides nucléiques
Face aux limites actuelles des autres méthodes de détection, la biologie moléculaire offre un m oyen supplémentaire d ’investigation non négligeable. Le principal intérêt de travailler directement sur le génome est de pouvoir se soustraire à l’influence des conditions environnementales.
La sensibilité, la spécificité, la fiabilité ainsi que la rapidité des techniques font de la biologie moléculaire un outil largement utilisé dans des domaines aussi divers que la phytopathologie, la médecine ou la microbiologie alimentaire (Miller & M artin, 1988; Barry et al., 1990; Bej et al., 1990; Bertheau & Tempé, 1990; Barry et a l, 1991; Bej et al., 1991a; M onstein et al., 1996; Fox, 1998).
Les deux propriétés principales des acides nucléiques exploitées pour la mise au point des techniques de détection sont (i) la capacité de deux chaînes monocaténaires complémentaires à former, sous certaines conditions de milieu et de température, des molécules double brins stables et (ii) la réversibilité de la dénaturation de l’ADN double brin en ADN simple brin.
1.3.7.1. Les techniques
1.3.7.1.1. L ’hybridation moléculaire
L ’objectif de l’hybridation moléculaire est de détecter spécifiquement une séquence d ’acides nucléiques à l’aide d ’une sonde nucléique marquée. Une sonde peut être d ’origine chromosomique ou plasmidique et sa taille est comprise entre 15-20 pb et 30 kpb (Fox, 1998).
Le marquage d ’une sonde peut s’effectuer à l’aide d ’éléments radioactifs mais comme la manipulation de ces radioéléments demeure contraignante et relativement dangereuse, leur utilisation pour la détection en routine n ’est pas envisageable. De ce fait, l’alternative em ployant un marquage non radioactif, dit “froid” , s’est fortement développée au cours de ces dernières années. De nombreux kits commerciaux de marquage et de détection sont désormais disponibles et leur sensibilité est devenue comparable à ceux utilisant des éléments radioactifs (Seal & Elphinstone, 1994; Fox, 1998). La détection de l’hybridation peut se faire par spectrophotométrie, fluorimétrie ou luminimétrie.
Le niveau de spécificité d ’une sonde est variable. Une sonde peut être discriminante au niveau du genre, de l’espèce ou même à un niveau infraspécifique. La spécificité des sondes est vérifiée soit par hybridation avec des profils de restriction d ’ADN totaux (teclmique RFLP, cf. chapitre 1.2.1.1.), soit par hybridation sur membrane de nitrocellulose ou de nylon avec de l’AD N extrait ou directement avec du lysat bactérien à partir d ’une collection bactérienne sous forme de spot (technique du dot-blot). Le dot-blot peut se réaliser également sur un échantillon biologique déposé directement sur la membrane. Les avantages du dot-blot sont sa simplicité, sa rapidité et le nombre élevé d ’échantillons que l’on peut tester simultanément (Fox, 1993). M ais la faible sensibilité de la teclmique d ’hybridation estimée généralement entre 105 à 106 ufc/mL fait qu ’elle est rarement employée comme moyen de détection directe sur échantillon biologique.
Néanmoins, la technique F1SH (pour fluorescent in situ hybridization) utilisée pour la détection de R. solanacearum dans des échantillons de plante, de sol et d ’eau s ’est avérée très efficace pour réduire le nombre de faux résultats positifs par immunofluorescence (Wullings et al., 1998).
1.3.7.1.2. La PCR
La PCR, depuis sa mise au point il y a environ 15 ans, a connu un développement considérable et est devenue comme l’ELISA une des techniques les plus employées en laboratoire. Ses caractéristiques font qu’elle est parfaitement adaptée à la détection en routine des bactéries phytopathogènes. Une difficulté majeure de son utilisation, en particulier dans les p a y s en voie de développement, est son coût qui reste, malgré d ’indéniables progrès, relativement élevé (Seal, 1995; Seal, 1998a).
La PCR conduit à l’amplification exponentielle in vitro d ’une séquence spécifique d ’ADN à l’aide de deux amorces complémentaires chacune d ’un des deux brins de l’A D N et d ’une A D N polymérase thermorésistante. En pratique, le nombre de cycles d ’amplification réalisé varie entre 20 et 35, soit un facteur d ’amplification d ’au moins 106. Chaque cycle se décompose en trois étapes : (i) dénaturation des deux brins d ’ADN, (ii) hybridation du couple d ’amorces encadrant la région à amplifier et (iii) synthèse par l’ADN polymérase des brins complémentaires. A près amplification, une électrophorèse est généralement réalisée en présence d ’un marqueur de masse moléculaire afin de vérifier, par sa taille, la nature du (ou des) fragment(s) amplifié(s).
La maîtrise de certains paramètres de la réaction comme le choix des amorces (logiciels disponibles), la tem pérature d ’appariement des amorces à l’ADN cible et la concentration des éléments constitutifs du milieu réactionnel, est essentielle pour assurer l’efficacité de cette technique.
La spécificité de la méthode est plus ou moins large. Elle peut être reliée à un ensemble de micro-organismes, à un pathogène déterminé, ou un groupe de souches. La spécificité peut être vérifiée et améliorée par une digestion du produit d ’amplication par une ou plusieurs enzymes de restriction (technique PCR-RFLP) ou par une seconde série d ’amplifications à l’aide d ’autres amorces ayant des sites d ’hybridation au sein du premier fragment amplifié (technique nested-PCR). La PC R présente l’avantage d ’être une méthode très rapide et applicable directement à un échantillon biologique. De plus, comme il s ’agit d ’une méthode très sensible, de très faibles quantités de populations bactériennes sont détectables. Cette caractéristique est très intéressante, en particulier pour la détection des infections latentes de R. solanacearum. M ais la puissance de cette technique fait que la moindre contamination de l’échantillon ou des réactifs peut engendrer de faux résultats positifs. Afin de minimiser les risques, des conditions de travail extrêmement rigoureuses doivent être observées. Par ailleurs, l’inhibition de la réaction PCR due à des substances présentes dans les échantillons biologiques est un phénomène fréquemment rencontré. Pour lever ces inhibitions de nombreuses possibilités existent (utilisation d ’adjuvants, purification d ’ADN, technique d ’immuno- ou séquence- capture-PCR,...) mais leur efficacité est plus ou moins grande selon les échantillons (Rossen et al., 1992; Wilson, 1997).
I. Synthèse bibliographique
1.3.7.2. S tratégies de rech erch e d ’une séquence n ucléotidique spécifique
1.3.7.2.1. Exploration des opérons ADNr
L ’exploration des opérons A D Nr est sans aucun doute l’approche la plus utilisée p o u r l’obtention de séquences spécifiques du genre, de l’espèce mais également à un niveau infra- spécifique. L ’ADNr 16S a été utilisé pour la détection spécifique de A. tumefaciens (Picard et al.,
1992), du groupe R. solanacearum/P. syzygii/BDB (Seal et al., 1993), et des sous-groupes de
R. solanacearum (Fegan et al., 1998a; Boudazin et al., 1999; Seal et al., 1999); l’A D N r 23S pour
la détection spécifique d ’£. amylovora (M aes et al., 1996) et du groupe
R. solanacearum/P. syzygii/BDB (Wullings et al., 1998). L ’ITS situé entre les fragments 16S et 23S de l’AD Nr, présentant une plus grande diversité, a permis d ’obtenir des fragments spécifiques d ’espèces ou de sous-espèces (Barry et al., 1991), par exemple pour
C. michiganensis subsp. sepedonicus (Li & De Boer, 1995), C.xyli subsp. xyli (Fegan et al.,
1998b) X. albilineans (Pan et al., 1997) et les sous-groupes de R. solanacearum (Fegan et al.,
1998a).
1.3.7.2.2. Gènes impliqués dans le pouvoir pathogène
La stratégie consistant à prendre pour cible les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène des bactéries phytopathogènes est également très souvent employée pour l ’obtention de séquences spécifiques, surtout au niveau infra-spécifique car les séquences de ces gènes sont plus variables que les ADNr.
Les gènes hrp ont ainsi été explorés et exploités pour l’amplification spécifique des souches de X. vesicatoria (Leite et al., 1995) de X. fragariae (Roberts et al., 1996) et du groupe
R. solanacearum/P. syzygii/BDB (cf. chapitres III. 1.1. et III. 1.2.). Les gènes codant pour des phytotoxines ont aussi été exploités avec succès. Par exemple, les sondes correspondant aux gènes responsables de la production de la phaséolotoxine et de la coronatine sont des sondes spécifiques respectivement des pathovarsphaseolicola et tomato de l’espèce P. syringae (Schaad
et a i, 1989; Cuppels et al., 1990). L ’amplication par PCR d ’un fragment du gène codant pour la phaséolotoxine s ’est révélée également spécifique de P. syringae pv. phaseolicola (Prosen et al.,
1993; Audy et al., 1996). La séquence des gènes codant pour des exoenzymes, endoglucanase et polygalacturonase, a permis la synthèse d ’amorces PCR pour l’amplification spécifique des souches du groupe R. solanacearum/P. syzygii/BDB et de P. syzygii (Gillings et al., 1993; Fegan
et al., 1998a).
1.3.7.2.3. Séquence d ’insertion (IS)
Les IS ont aussi été exploités mais plus rarement dans un but d ’identification par hybridation moléculaire ou PCR. Des IS ont été utilisés pour différencier X. oryzae pv. oryzae
des nombreux pathovars d e . ï campestris (Leach et al., 1990), et pour identifier X. campestris
pv. dieffenbachiae (Berthier et al., 1994) s\X . oryzae pv. oryzae (George et al., 1997).
fra g m e n té p a r ultra-sons
( F r a g m e n t s d e 6 0 0 à 2 0 0 0 pb )
une enzyme de restriction
( F r a g m e n t s d e 2 5 0 p b e n m o y e n n e )
Mélange et dénaturation des ADN par chauffage (100 °C, 10 min)
Hybridation soustractive (86 °C, 16 h puis 76 °C, 3 h)
*
I
Clonage dans un vecteur (pUC 18) des fragments d ’ADN cibles renaturés et transformation de cellules d ’£. coli compétentes par les plasmides recombinants.
I. Synthèse bibliographique
1.3.7.2.4. Exploration du génome entier
Cette technique consiste à réaliser une banque génomique de la bactérie à détecter puis à rechercher parmi les différents clones obtenus une séquence nucléotidique spécifique. Le criblage de cette banque est assez lourd puisqu’il est nécessaire de tester, séparément par hybridation moléculaire, chaque clone pour sa spécificité vis-à-vis du micro-organisme.
1.3.7.2.5. L ’hybridation soustractive (ou soustraction génomique)
Le principe de cette technique (figure 1-9) est de soustraire du génome d ’un organisme dit cible toutes les séquences q u ’il possède en commun avec un organisme dit soustracteur afin de ne conserver que celles qui sont spécifiques à cet organisme cible (Fox, 1998). Le choix des organismes cibles et soustracteurs peut permettre de cibler des séquences différentielles codant pour des caractères physiologiques, écologiques ou pathogènes. En général, il est préférable de choisir des organismes taxonomiquement proches (Manceau et al., 2000a). Par cette teclmique, plusieurs fragments d ’ADN spécifiques d ’£. carotovora subsp. atroseptica (Darrasse et al.,
1994), de P. syringae pv. pisi et de X. axonopodis pv. phaseoli (M anceau et al., 2000b) et de
Xylophilus ampelinus (M anceau et al., 2000a) ont été isolés. Cette technique s ’est également avérée efficace pour l’obtention d ’une sonde spécifique de R. solanacearum (Seal et al., 1992a) et d ’une majorité des souches de la race 3 de R. solanacearum (Cook & Sequeira, 1991b).
1.3.7.2.6. Exploitation des techniques d ’analyse de la diversité génomique
Les techniques RAPD et rep-PCR sont très utiles pour différencier des souches au niveau de l’espèce et surtout au niveau infra-spécifique (Stead et al., 1997), mais comme leur utilisation requiert une purification préalable du pathogène, ces méthodes ne permettent pas une détection
in situ dans les échantillons de plantes, de sols ou de semences (Louws et al., 1994; Fox, 1998). Par exemple, la RA PD autorise la différenciation des sous-espèces atroseptica et carotovora d’E. carotovora (Parent et a l, 1996) et la discrimination des pathovars maculicola et tomato de
P. syringae (Clerc et al., 1998). La rep-PCR permet l’identification de pathovars de
Xanthomonas et Pseudomonas (Louws et al., 1994) et des cinq sous-espèces de
C. michiganensis (Louws et al., 1998).
La détection directe in situ des agents pathogènes est toutefois envisageable en sélectionnant les marqueurs RAPD polymorphes. Ces marqueurs peuvent être clonés puis séquencés, rendant possible la synthèse d ’un couple d ’amorces dirigeant l'am plication d ’un fragment appelé alors SCAR (pour Sequenced-Characterized Amplified Region) qui aura une forte probabilité d ’être spécifique. Cette technique a notamment été utilisée pour la détection spécifique de X. campestris pv. pelargonii (Manulis. et al., 1994), X. fragariae (Pooler et al.,
1996), X. campestris pv. phaseoli var. fuscans (Toth et al., 1998) et des races de P. syringae pv.
phaseolicola (Gonzalez et al., 1998). Une démarche identique peut être envisagée pour toute technique fournissant une empreinte génétique en particulier pour l’AFLP qui peut générer de multiples marqueurs polymorphes. Par exemple, l’étude AFLP de souches de R. solanacearum
(cf. chapitre III. 1.2.) a révélé (sous réserve de confirmation) des marqueurs spécifiques de groupes de biovar, de biovar ou encore d ’une origine géographique.