Méthodes d ’analyse fréquemment utilisées 1. La RFLP

La technique RFLP (pour Restriction Fragment Length Polym orphism ) implique de digérer l’A D N total bactérien par une ou plusieurs enzymes de restriction puis de séparer les fragments résultants par électrophorèse. Les fragments sont ensuite transférés et fixés sur une membrane de nylon et une hybridation est réalisée avec une sonde marquée afin de m ettre en évidence les fragments possédant une homologie de séquence avec l’ADN sonde. La comparaison des profils d ’hybridation constitue donc un moyen de déterminer l’existence ou non d ’un polymorphisme (figure 1-2).

La technique RFLP est très employée même si elle se révèle lourde à mettre en oeuvre. L ’utilisation de plusieurs combinaisons sondes/enzymes peut permettre d ’étudier le polymorphisme sur une partie importante du génome, dans des régions codantes ou non codantes selon l’origine de la sonde. Ces sondes correspondent soit à des séquences uniques soit à des séquences répétées du génome.

Parmi les séquences uniques, les gènes hrp (hypersensitive response and pathogenicity) impliqués dans le pouvoir pathogène des bactéries phytopathogènes ont été utilisés. Les travaux effectués sur plusieurs espèces de X anthom onas et sur P. syringae ont montré que la structure de ces gènes est bien conservé chez un même pathovar (Legard et al., 1993; Leite et al., 1994a; Scholz et al., 1994; Gagnevin et al., 1997). L ’étude de ces gènes a permis de scinder l’espèce R. solanacearum en deux divisions corrélées à l’origine géographique des souches et révélée de la diversité au sein des biovars et races de cette espèce (Cook et al., 1989). Les gènes impliqués dans la synthèse du tryptophane, d ’exopolysaccharides, ou de la 13-glucosidase ont aussi été utilisés afin de compléter les données obtenues par d ’autres sondes (Cook et al., 1989; H endson et al., 1992).

Parmi les séquences répétées, les ADN ribosomiques sont très souvent utilisés. Les A D N r sont présents au sein du génome organisés en opérons (rrn) (figure 1-3) dont le nombre varie d ’un micro-organisme à l ’autre (entre 1 à 13 copies) (Barry et al., 1990; Schmidt, 1998). Le fragment 16S de l’A D N r codé par le gène rrs est même devenu une région cible pour toutes analyses de relations phylogénétiques entre taxons, même éloignés, en raison de sa structure très conservée et de sa distribution universelle (Woese, 1987). Les ITS (pour Internal Transcribed Spacer) sont plus variables, car moins soumis à sélection, et révèlent fréquemment un polymorphisme au niveau infra-spécifique (Barry et al., 1991). Le ribotypage a permis de mettre en évidence de la diversité au sein d ’£. chrysanthemi corrélée à l’origine géographique (N assar et al., 1994) et au sein de plusieurs espèces de Xanthom onas (Bragard et al., 1995) et de différencier par exemple les deux pathovars, cassavae et manihotis, de X. axonopodis pathogènes du manioc

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I. Synthèse bibliographique

(Verdier et a l , 1993; Verdier et al., 1994). La variabilité existant dans cet opéron est aussi souvent exploitée dans un but d ’identification ou de détection des bactéries phytopathogènes (Seal et a l , 1993; Li & De Boer, 1995; Maes et al., 1996;Fegan et al., 1998a; Wullings et al., 1998; Boudazin é t a l , 1999).

Les gènes a vr (pour avirulence) sont moins répandus chez les bactéries et ils sont généralement présents en plusieurs copies dans le génome. Le gène aw X a lO a perm is de révéler du polymorphism e au sein de X. oryzae pv. oryzae (Adhikari et al., 1995) et de X. pv. mangiferaeindicae (Gagnevin et a l , 1997), correlé à l’origine géographique et parfois à l’hôte. Le gène p thB de la famille des gènes avr-pth a révélé une grande variabilité chez X. axonopodis pv. manihotis corrélée à l’origine géographique des isolais (Restrepo & Verdier,

1997).

Les éléments mobiles, IS (pour Insertion Sequence) et transposons, considérés comme sélectivement neutres, peuvent être également une cible pour analyser la diversité génétique des bactéries. Le nombre de copies d ’IS dans un génome est très variable (de une à plusieurs centaines) de même que leur taille (de 768 pb à 7,1 kpb, mais généralement entre 1 et 1,5 kpb) (Chandler, 1998). Les IS (figure 1-4), situés au niveau du chromosome ou de plasmides, sont caractérisés par des séquences répétées inversées à leurs extrémités (de 9 à 41 pb) encadrant une région comprenant un ou plusieurs gènes codant pour une transposase qui est à l’origine du caractère mobile de ces éléments. Par ailleurs, une duplication de la séquence cible d ’insertion (moins de 10 pb) est fréquemment observée. Les transposons sont des plus grandes séquences constituées ou non de deux IS similaires voire identiques encadrant une région portant un ou plusieurs gènes impliqués généralement dans la résistance aux antibiotiques (Chandler, 1998). Les IS ont été m is en évidence chez les bactéries phytopathogènes du genre P seudom onas (Hanekamp et al., 1997; Gonzalez et al., 1998; Hasebe et al., 1998), ou Agrobacterium (Simon et al., 1991), chez R. solanacearum (Thoquet & Trigalet, 2000) mais leur utilisation pour des analyses de diversité n ’a été effectuée que pour les Xanthom onas : X. oryzae pv. oryzae (Nelson et al., 1994; Adhikari et al., 1995; Ardales et al., 1996; Vera Cruz et al., 1996; George et al., 1997), X . pv. mangiferaeindicae (Gagnevin et al., 1997), X. axonopodis pv. dieffenbachiae (Berthier et al., 1994). Cette diversité, souvent corrélée àTorigine géographique et à l’hôte, peut- être exploitée à des fins d ’identification et d ’épidémiologie (Berthier et al., 1994; Ardales et a l, 1996; Vera Cruz et al., 1996) notamment par la synthèse d ’amorces PCR spécifiques d ’IS permettant l’amplification des régions localisées entre deux IS (technique IS-PCR) (George et al., 1997). Une variante de l’IS-PCR, la LM PCR (pour Ligase-Mediated PCR), reposant sur la digestion de l’A D N par une ou plusieurs enzymes de restriction entre deux IS puis sur l’amplification des séquences flanquant des IS grâce à la ligature d ’adaptateurs spécifiques, a permis de révéler l’existence de migrations régionales des souches de X. oryzae pv. oryzae (George et al., 1997).

Il existe une variante de la technique RFLP, la PCR-RFLP, qui consiste à digérer un fragment amplifié par PCR à l’aide d ’une ou plusieurs enzymes de restriction. Cette technique révèle plus ou moins de polym orphism e (au niveau de l’espèce ou au niveau du pathovar ou du biovar) selon la région amplifiée {hrp, A D Nr 16S, ITS, IS, gène codant pour une polygalacturonase) (Gillings et al., 1993; Leite et al., 1994b; Nesme et al., 1995a; Ito et al., 1996; George et a l , 1997; M anceau & Horvais, 1997; Tsuchiya & Horita, 1998).

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1.2.1.2. La RAPD

Basée sur le principe de la PCR, la technique RAPD (pour Random Amplified Polymorphic DNA) consiste à amplifier, de manière aléatoire sur l’ensemble du génome, l’A D N à l’aide d ’amorces courtes (environ 10 pb) dans des conditions souvent peu stringentes (hybridation à basse température) (Williams et a l , 1990). Une seule amorce perm et l’amplification de plusieurs fragments (dépassant rarement la dizaine) d ’ADN. L ’utilisation de plusieurs amorces permet la plupart du tem ps de détecter un grand nombre de marqueurs polym orphes neutres.

La RAPD est une technique simple, rapide, ne nécessitant pas d ’analyse préalable du génome, mais présente une grande sensibilité aux conditions expérimentales. Dès lors, seules des conditions de préparation des échantillons et des cycles PCR bien optimisés peuvent assurer l’obtention de profils reproductibles (Meunier & Grimont, 1993).

La RAPD a permis de mettre en évidence une diversité infra-spécifique chez X. albilineans (Permaul et al., 1996) et X. fragariae (Pooler et a l , 1996), de différencier les sous-espèces atroseptica et carotovora de E. carotovora (Parent et al., 1996), de discriminer les pathovars m aculicola et tomato de P. syringae (Clerc et a l , 1998). La RAPD a été utilisée po u r estimer la diversité existant au sein des populations de R. solanacearum présentes dans une zone géographique restreinte à des fins épidémiologiques (Ito et al., 1996; Jaunet & Wang, 1998; Jaunet & Wang, 1999) et les relations génétiques entre souches de R. solanacearum inféodées à M usa sp. (Thwaites et al., 1999).

1.2.1.3. La rep-PCR

La méthode rep-PCR repose sur l’utilisation de petites séquences répétées dans le génome bactérien, les éléments REP (pour Repetitive Extragenic Palindromie, 35-40 pb) ERIC (pour Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, 124-127 pb) et BOX (composés des sous- unités boxA, 59 pb; boxB, 45 pb et boxC, 50 pb) (Versalovic et a l , 1991; Versalovic & Lupski, 1998; Versalovic et al., 1994). Les éléments REP et ERIC, situés en positions intergéniques, auraient un rôle dans la régulation et la stabilité des ARN messagers, les éléments B O X sont moins connus. Des amorces correspondant aux extrémités de ces séquences répétées sont utilisées afin d ’amplifier par PCR les fragments situés entre ces séquences répétées, dans la limite d ’une distance compatible avec les capacités d ’amplification par PC R (5 kpb environ). Le polymorphism e est principalement dû à une différence de localisation des séquences REP, ERIC et BOX (Versalovic & Lupski, 1998).

La rep-PC R est fréquemment citée comme une méthode reproductible, discriminante surtout par l ’utilisation des éléments REP et ERIC; les éléments BOX étant plus conservés, utilisable à des fins d ’identification et d ’épidémiologie, et perm ettant une bonne estim ation des distances génétiques entre diverses unités taxonomiques (Versalovic et a l , 1994; Louw s et a l , 1995; De Bruijn et al., 1996; Pooler et a l , 1996; Vera Cruz et al., 1996; Darrasse et al., 1998; H orita & Tsuchiya, 1998; Louws et al., 1998). Plusieurs espèces ou pathovars des genres Pseudom onas et Xanthom onas ont pu être différenciés sur la base des profils générés par la rep- PCR (Louws et a l , 1994). Au niveau d ’un pathovar, la diversité est plus ou moins grande (Louws e ta l., 1995; Vera Cruz et al., 1996). Cette technique s ’est également avérée très utile pour estimer la diversité des souches de R. solanacearum présentes au Kenya (Smith et al.,

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