- [OOXXDVODVDXDYXDO | _ I VVDXDáXOVDXVDDVÕI
1.3.4. Les m éthod es traditionnelles de détection
1.3.4.1. L a c u ltu re s u r milieu gélosé
La méthode consiste à cultiver les cellules bactériennes présentes dans le liquide d ’extraction sur un milieu nutritif gélosé pour obtenir des colonies séparées.
Des dilutions de l’échantillon sont tout d ’abord effectuées. Une aliquote de chaque dilution est alors déposée (plusieurs répétitions) à la surface d ’un milieu gélosé contenu dans une boîte de Pétri et étalée sur trois secteurs afin d ’opérer une séparation des différents germes présents dans le liquide d ’extraction et dont la concentration est inconnue. Le but est d ’obtenir des colonies séparées, donc aisées à cloner (culture pure), dans le troisième secteur après une incubation entre 25 °C et 27 °C, température de croissance optim um pour la majorité des bactéries phytopathogènes (Gardan & Luisetti, 1982; Rudolph et a l , 1990; Fox, 1993). Cependant, pour parvenir à la certitude d ’un clone pur, une ou plusieurs subcultures sont nécessaires. Le délai d ’apparition des colonies caractéristiques sur le milieu de culture est en général compris entre 36 à 72 h mais il peut être de six à quatorze jours pour X. albilineans, X. fragariae o u Xylophilus ampelinus (Rudolph et al., 1990).
Certains milieux gélosés, comme le milieu LPGA (pour Levure, Peptone, Glucose, Agar), sont utilisables pour isoler la plupart des bactéries phytopathogènes. D ’autres, en revanche, sont plus spécifiques comme le milieu B de King (King et al., 1954) pour les Pseudomonas fluorescents ou les milieux de Kelman (Kelman, 1954), Granada et Sequeira (Granada & Sequeira, 1983b) et SMS A (Engelbrecht, 1994) pouj- R. solanacearum.
•(sip u u osjsd uopeoranunuoo ‘irepjBQ) (98 61 ) sn o o o D o p o ^ p ( 9 8 g ])
iu n u3i3o q o p n j ‘(t?86l) J W v q m v fò ■ sanreã £ ua sassiAipqns 91? juo sau^OBqauXjOQ sauuapire *
|3nbî^Aiou73D>d) PJO/IOJOJDJ) d~i ooyq~t»¡¡ xuonoihury VIHJAU3 + -. -
-^Hr
?l^V3uauu>j -WTLÍV9DVU-ojo» )u»9i*)oni) uou
svNOHoorasà * • :
--4 '
JTavpXxo -oiAvia) lOTll»! »P S 3» >'C ; * : • ja-jboT -oipvdoTjXijd) 30in»T »p £ 't ' SVNOHOHINVX • - - ---
c=>. HMUlLDVaOHDV r • - * - ' ^ c = . ‘j \9u»\ovJumo ~SDlJ ‘D) A»6j>o np S ®drvojb A»bj»a np »àno30 - * - - — = » • • * - • - -3jnoao 3UN3D =»q»J. z i m n -1SM3S -U3JAH asvowo S31 VU-LIN S30 MC! J daotw 3DH3D -s3nom j S3xi30vnj ainiBOw UOSJ7»'] :>;» ybn» 3sc o m o no moi jL v s n u n wvay‘(Z861 ‘P)»sinT i» uEpjB O sa jd i^ p ) sou?3oii)Bdo)^iid s o u o p e q ap s o d n o jâ s p u B j 3 sop u o i j B j u D u o . p s o j o p e j b o -9 - 1 nBaïqBj,
L ’avantage de la technique est qu’elle ne nécessite que le matériel courant de laboratoire de microbiologie, et de plus elle s ’avère très sensible puisque sa limite de détection est estimée à 102ufc (unité formant colonie)/mL (Tourte, 1993). Le nombre de répétitions est très im portant car il détermine la sensibilité de la méthode. Toutefois, cette technique n ’est pleinement efficace que si les populations de la microflore saprophyte ne sont pas trop nombreuses (Rudolph et al., 1990; Fox, 1993). C ’est pourquoi la mise en culture de bactéries extraites de milieu très pollué, comme le sol, est souvent difficile. La mise au point de milieux sélectifs, favorisant la croissance des agents pathogènes recherchés au détriment de celle des saprophytes, peut pallier à cet inconvénient. La sélection s ’effectue par l’introduction dans le milieu de sources de carbone et/ou d ’azote spécifiques, d ’antibiotiques ou encore de colorants (Rudolph et al., 1990). Néanmoins pour ces milieux, se pose le problème de la sélectivité (nombre ou proportion des souches de l’espèce et hors de l’espèce poussant sur le milieu) (Luisetti, communication personnelle).
I.3.4.2. La c ara cté ris atio n , les profils biochim iques
Les méthodes classiques d ’identification des bactéries phytopathogènes isolées en culture pure font appel aux caractéristiques culturales, cytologiques et biochimiques des populations bactériennes. L ’identification peut se faire au niveau genre, espèce, pathovar, biovar,...
Pour orienter le diagnostic, on s ’intéresse aux caractères culturaux (couleur, forme des colonies, vitesse de croissance), aux caractères morphologiques et cytologiques (coloration de Gram, étude de la mobilité, localisation des flagelles) ainsi qu’à diverses caractéristiques bactériologiques (type métabolique, production de pigments fluorescents, pouvoir pathogène, présence d ’une nitrate réductase, d ’une cytochrome c oxydase) (Kiraly et a l , 1970; Gardan & Luisetti, 1982; Hayward, 1990; Rudolph et al., 1990). Ces caractères d ’orientation perm ettent l’identification des bactéries au niveau du genre (tableau 1-6). Cette identification peut également s ’effectuer à l’aide du système BACTID qui propose une série de tests présentés sous forme de kit.
Pour aboutir au diagnostic d ’espèce, de pathovar ou de biovar, une caractérisation complémentaire est requise. De multiples tests biochimiques ou nutritionnels (assimilation de différentes sources de carbone, production d ’enzymes) sont utilisables. Les tests miniaturisés et standardisés de marque API® (tests en microtubes) ou BIOLOG® (tests en plaque de microtitration) sont très pratiques et très reproductibles (Fox, 1993). Ainsi le profil d'assimilation de 99 ou 95 substrats carbonés (plaques API ou BIOLOG) complété par des caractères variés (amylolyse, pectinolyse, cellulolyse, gélatinolyse, test tabac,...) constitue un m oyen très complet et très rapide (réponse entre 24 et 48 heures) de caractériser une souche bactérienne (Black & Sweetmore, 1993). L'utilisation d'une bibliothèque de souches de référence permet, en théorie, une identification efficace (logiciels disponibles). En utilisant le systèm e BIOLOG®, 96 % des souches de Pseudomonas phytopathogènes (dont des souches de R. solanacearum) (Li & Hayward, 1993) et 92 % des souches de R. solanacearum (Black & Sweetmore, 1993) ont été correctement identifiées au niveau de l’espèce; en revanche, l’identification au niveau du biovar est beaucoup plus incertaine.
Cependant, on se limite en général à comparer la souche à identifier à (aux) la souche(s) de référence sur un nombre plus restreint de caractères, qui se sont révélés assez stables po u r l'entité concernée. Ainsi, environ vingt caractères sont sélectionnés et mis en oeuvre, en routine, pour identifier la plupart des bactéries phytopathogènes (espèce ou pathovar). Le tableau 1-7 présente comment sont identifiés les Pseudomonas fluorescents. Quant au tableau 1-8, il illustre les caractères distinctifs de différents pathoyars de l’espèce P. syringae.
- - - - - + - - aooisuad - - - - -
-
- - / + D¡03J¡0SSVlld - - - - / + - - - - V3Up/(¡8 - - - - + + - / + - istd + - - - - / + - / + - - WUD1SOAOS + --
- / + + +-
- lunuourudsuoiu - + - - / + + - / + - / + - / + v\oo\¡novuÁ-
+ --
+ + + - / + OlVWOJ - - / + - / + + + + + + 0t>Suu/(s s;b j o b[ avSuuKs j(+)1
( • )a
- i a l o j X j i p X j g l o j i s o u j j o j i q j o s s u i j n o s g 3S/i|OUIJB13£) S p JB AO qjB J*(Z86I ‘!W*s!nrI î 9 uB p j« f) sa jd iîtp) avSuuAs svuoiuopnzsj aD3cls9ti ap sjuAoijjud s a n b p n b ap s j i p u ij s ip s a j a p B J t Q nBajqujL
•3iniii.i3j3p uou : O N '• •!• •SSAIJISOd S9SUOd3J 3p % 6¿ ? 13 ^ A : * - - + Q H ( I N - s je jje d s y - a - - - - + a N A ssouuicij'y - T - - - ■ ■ ■ 3S0u;qBJV - a A + “ - - A 9JBJÍ.IB1 - a A + + - + A 3jB.ij.iex - q A - - ■ ■ + SSOJBipOBS - - " “ A + 3SO|BlJ3.ll A + - - + + lo jjq jo s - - - ■ * " 3S 0 jq 0 ||3 3 - - - + “ • 3JB0ZU3Q A + + + + + 10J1UUBJAI - - - ■ ■ ■ Oo lt7 ? 33UBSS|0J0 - - - - - " 3SBJ0np3.l 3JBJJJM - - - - - + 3SB|0jpXqip 3u;u|o.iv - - + + + + 3SBpXxO )k A - “ - " + 3UBA3T
dvSuu/(s j ViWlfiptMA J JUOVfOp J avo u vS v ¿ USVVJOJ J sijoutS uoiu ¿
•(8861 ‘PBBR’ S s s jd e . p ) S)U33S9JOnU SVUOlUOpmSJ 3p S333CÏS3 S3nb|3nb 3p S|3IJU3J3JJip S3J3J3BJB3 ’¿ ‘I n e 3 iq B l
I.3.4.3. Le pouvoir pathogène
Ce test biologique consiste à inoculer une culture bactérienne à la plante-hôte dans le but de reproduire les sym ptôm es typiques de la maladie. Il s ’agit d ’une étape incontournable du principe de Koch. L ’exploration du pouvoir pathogène se révèle très utile pour différencier des bactéries qui ont des caractéristiques biochimiques identiques : par exemple les pathovars p is i et syringae de l’espèce P. syringae (Grondeau, 1992), ou A. tumefaciens et A. radiobacter (Gardan & Luisetti, 1982). Il permet également l’identification des différentes espèces ou pathovars de Xanthomonas (M offett & Croft, 1983).
L'expression du pouvoir pathogène requiert des conditions bien précises qui, faute d ’être correctement remplies, entraînent un résultat négatif et par conséquent une difficulté d'identification. Il faut (i) avoir une plante sensible au stade sensible, (ii) posséder un inoculum suffisant à la fois en quantité et en qualité, (iii) connaître les meilleures voies d ’inoculation (naturelles ou artificielles), (iv) savoir quelles sont les conditions environnementales les plus favorables à l’apparition et au développement des symptômes (Klement et a!., 1990).
Pour reproduire avec succès les sym ptômes caractéristiques d ’une maladie, la dose d ’inoculum recommandée est généralement de l’ordre de 107 à 108 ufc/mL. Selon l’agent pathogène, l’inoculation peut se réaliser par pulvérisation à la surface de la plante, trempage des racines (R. solanacearum; Nicole, 1995), injection au niveau de la tige,... (Klement et al., 1990).
La reproduction des sym ptômes qui demande entre cinq et quinze jours en général poul ies bactérioses des cultures légumières et florales nécessite en revanche plusieurs mois pour les maladies des arbres fruitiers (Gardan & Luisetti, 1982).
Il s ’avère que l’épreuve du pouvoir pathogène est une méthode lourde (infection de plusieurs plantes pour un même échantillon), longue (comparée à d ’autres méthodes d ’identification) et onéreuse (entretien de serre, de chambre climatique ou encore de p h ytotron). L’ensemble de ces conditions fait que ce test sert souvent à confirmer une identification présom ptive.