Suivi de l’activité thérapeutique du 2-thioUTP contre la calcification aortique

Pour faire suite à la preuve de concept d’imagerie des fibroblastes cardiaques présentée au chapitre 6, les outils lamellaires sensibles au pH ont été appliqués lors de la démonstration d’un mécanisme thérapeutique du 2-thioUTP par le groupe du Dr. Patrick Mathieu à l’IUCPQ.14 _{Notamment, ces travaux ont permis de}

déterminer que le composé favorise l’acidification extracellulaire par un effet agoniste du récepteur P2Y2, qui promeut l’expression d’une enzyme membranaire (anhydrase carbonique, CA XII). La protéine agit sur l’acide carbonique dissout afin de le dissocier en un proton et un bicarbonate, ce dernier traversant la barrière phospholipidique grâce à un transporteur spécifique. Ainsi, le 2-thioUTP pourrait être utilisé pour provoquer la régression de valvulopathies reliées à une calcification des artères comme la sténose aortique.

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Dans le cadre de cette collaboration, le pH de tissus a été imagé après le traitement de souris avec l’agent thérapeutique dans un environnement non-tamponné. Des coupes histologiques murines ont donc été déposées sur les lamelles sensibles au pH, observées en microscopie de fluorescence, puis traitées avec la normalisation d’excitation à 490 et à 440 nm des nanoparticules Ag@SiO2+FL (Figure 7.18). L’acidification

extracellulaire induite par le 2-thioUTP dans les tissus aortiques jusqu’à un pH extracellulaire moyen de 6,5 est statistiquement significative par rapport au contrôle à 7,3. Le mécanisme de médiation par l’expression de CA XII a aussi été validé par un traitement simultané avec un inhibiteur spécifique, l’acétazolamide (ACTZ), afin de retourner aux valeurs neutres. Cette hypothèse a été confirmée en culture cellulaire in vitro par la caractérisation du pH extracellulaire avec la microscopie d’épifluorescence et intracellulaire avec la cytométrie en flux (Figure 7.19). Puisque l’activité des anhydrases carboniques provoque la dissociation de l’acide carbonique et que la membrane biologique supporte des transporteurs sélectifs aux anions bicarbonate, l’application de l’agent thérapeutique mène à une acidification du milieu à proximité et à une basification du cytosol. L’ajout du sel dibasique de l’acide 4-acétamido-4’-isothiocyanato-2,2’- stilbènesulfonique (SITS), un inhibiteur spécifique aux pompes à bicarbonate, confirme l’action mécanistique proposée pour le 2-thioUTP avec une augmentation notable du pH extracellulaire dans ces conditions.

Figure 7.18 : Gauche – Imagerie ratiométrique de coupes histologiques de valves aortiques murines d’un contrôle calcifié sans traitement (CTL), un échantillon mis en contact avec le 2-thioUTP (2tUTP), et un échantillon mis en contact avec le 2-thioUTP et l’acétazolamide, un inhibiteur de CAXII (2tUPT+ACTZ). La

barre d’échelle représente 50 μm. Droite – Valeurs de pH sous la coupe mesurées pour les échantillons précédents.

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Figure 7.19 : A) Valeurs de pH extracellulaire (pHe) mesurées en microscopie d’épifluorescence à 10 μm de cellules fibroblastes cardiaques contrôles (CTL), mises en contact avec l’agent thérapeutique (2tUTP), ou avec le 2-thioUTP et le SITS, un inhibiteur des transporteurs de bicarbonate (2tUTP+SITS, 50 μM). B) Valeurs de pH intracellulaire (pHi) mesurées par cytométrie en flux pour des cellules marquées avec

BCECF-AM (2 μM), un fluorophore pH sensible.

La validation du mécanisme associé à cette molécule agoniste est particulièrement intéressante afin de comparer deux méthodes couramment utilisées dans les laboratoires de recherche médicale. Tout d’abord, l’acquisition de valeurs de pH extra- et intracellulaire permet de constater la complémentarité des techniques analytiques de microscopie optique et de cytométrie en flux. Dans un cas, l’interaction lumière-matière est utilisée sur un échantillon in vitro de façon non-destructive afin d’obtenir des données à une certaine position par rapport aux cellules. Dans l’autre, la cadence analytique de la méthode permet de sonder rapidement un nombre significatif de cellules et de tracer un profil statistique des valeurs de pH intracellulaires. Ces deux techniques permettent aussi d’illustrer les atouts associés à l’utilisation de lamelles sensibles au pH implantables directement in vitro. Comme les nano-capteurs se retrouvent confinés dans l’environnement extracellulaire, il n’y a pas modification du milieu de culture des cellules comme c’est le cas lors de l’incubation avec 2 μM de BCECF-AM afin d’ajouter une signature de fluorescence pour les expériences de cytométrie. De plus, plutôt que de donner des résultats ponctuels à un moment donné dans le temps de culture cellulaire, la microscopie de fluorescence est une alternative non-destructive de faire le suivi du métabolisme avec une résolution temporelle et spatiale. En effet, bien que des études cinétiques en cytométrie soient possibles avec des cellules à différents stades de leur croissance, la préparation des échantillons et l’acquisition des données deviennent rapidement trop lourdes pour en faire une analyse de routine. À l’opposé, la collecte d’informations en intensité de fluorescence directement durant la culture peut être automatisée avec des enceintes d’incubation et la programmation de commandes instrumentales. Ensuite, les montages de microscopie inversée offrent la possibilité d’utiliser des outils comme les lamelles sensibles afin de sonder le pH à même la tranche de tissus. La richesse des informations présentées dans

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des images comme celles de la Figure 7.18 permet de tirer un maximum de données biologiques et rend possible une nouvelle gamme d’analyses pour les études mécanistiques de thérapies médicales.

En ce sens, ce genre d’applications démontre bien le contexte analytique des substrats supportant une activité pour la mesure quantitative du pH. Par exemple, le suivi non-destructif de cellules excitables (neurones, fibroblastes cardiaques, cellules nerveuses, etc.) permet de diriger la recherche médicale dans le cas de certaines maladies dégénératives et d’améliorer l’élucidation de ces mécanismes. La cartographie quantitative du pH avec une architecture généralisable pour d’autres ions ouvre alors la porte pour l’imagerie d’autres paramètres afin de suivre de nouveaux mécanismes auparavant inaccessibles comme les mesures membranaires en fluorescence ou les synapses neuronales.

7.3 Références

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(2) Diehl, H. ON FLUORESCEIN-VI Absorbance of the Various Prototropic Forms of Yellow Fluorescein in Aqueous Solution. Talanta 1989, 36 (3), 413–415.

(3) Lakowicz, J. R. Plasmonics in Biology and Plasmon-Controlled Fluorescence. Plasmonics 2006, 1 (1), 5–33.

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8 Conclusion et perspectives

Au cours de ces travaux de doctorat, différents capteurs bénéficiant de l’exaltation de leur signal sensible au pH ont été optimisés puis présentés dans plusieurs contextes sur des substrats comme support. L’étude fondamentale du MEF pour les nanoparticules plasmoniques d’argent et d’indium ont donc permis de concevoir des colloïdes cœur-coquille contrôlés avec un signal maximal en tant que marqueur en fluorescence. Malgré la séquence rationnelle de la synthèse des architectures cœur-coquille, suivie de leur étude fondamentale et de leur fonctionnalisation sur des surfaces de silice, la chronologie réelle du projet ne correspond pas directement à la séquence présentée dans ce document de thèse. Par exemple, la préparation des premiers capteurs lamellaires s’est faite en utilisant des cœurs d’argent plus polydisperses qu’avec la synthèse optimisée par croissance de germes. Ainsi, ce dernier chapitre fera le point sur les perspectives et avancements possibles de ces travaux, autant pour le développement de nanoparticules sensibles que pour leur application sous différentes formes.