Incorporation d’espèces sensibles dans des nano-architectures

L’ajout de propriétés analytiques à partir de la structure de nanomatériaux est profitable de plusieurs manières. Parmi ceux-ci, le suivi de marqueurs individuels est rendu possible par l’incorporation d’un nombre élevé de rapporteurs moléculaires dans un volume de dimensions inférieures à celles des organites biologiques et des cellules. La bonne luminosité de ces objets nanoscopiques ainsi que la protection des fluorophores dans une architecture fonctionnalisable ouvre donc la porte à plusieurs applications plus difficiles à accomplir avec les mêmes marqueurs moléculaires.

Par exemple, alors que la fluorescéine montre des propriétés sensibles au pH mais aussi plusieurs désavantages spectroscopiques, les travaux de He et al. ont présenté son application lorsqu’encagée dans des MOFs (metal-organic frameworks, structure F-UiO) pour des mesures de pH intracellulaire en microscopie (Figure 2.16).62 _{Une normalisation par ratiométrie est possible en utilisant les propriétés}

variables des formes protonées et déprotonées de la molécule afin de corriger certaines fluctuations instrumentales et environnementales. Ces capteurs d’environ 100 nm permettent donc de rapporter des valeurs de pH quantitatives fiables en conditions biologiques dans la même gamme que l’émetteur moléculaire, c’est-à-dire entre 5,0 et 7,0 (±une unité de pH à partir du pKA, pour représenter une espèce

majoritaire à 90%). De plus, lorsque placées dans des milieux de culture in vitro, les systèmes F-UiO pénètrent par endocytose dans l’environnement cytosolique en quelques heures. Les avantages analytiques de la normalisation ratiométrique sont alors mis de l’avant durant le suivi du signal en fonction du temps

28

puisque les MOFs peuvent être distingués en fonction de leur emplacement dans la cellule. Une acidification graduelle du cytosol se produit en quelques minutes, tandis que la fluorescence des capteurs immobilisés sur la membrane demeure inchangée. Il est à noter que les valeurs perçues sont quantitatives par la calibration faite directement dans des conditions similaires à celles retrouvées dans les expériences in vitro.

Figure 2.16 : A) Représentation schématique de la préparation des architectures MOFs incorporant l’isothiocyanate de fluorescéine. B) Calibration en intensité ratiométrique de fluorescence pour les MOFs

en fonction du pH. C) Illustration par superposition des canaux provenant de l’excitation des MOFs avec FiTC à 488 nm (vert) et à 435 nm (rouge).62

Les matrices nanoscopiques montrent plusieurs avantages pour incorporer plusieurs molécules sensibles dans une architecture unique. Toutefois, le groupe de Daniel T. Chiu ont amélioré ce concept afin d’ajouter une fonctionnalité de fluorescence à même la matrice polymérique semi-conductrice.63 _{Ces compositions}

résonantes ouvrent alors la porte à une correction ratiométrique en utilisant l’énergie absorbée par la particule vers un accepteur FRET qui est sensible au pH. De cette façon, les paires FRET composant ces émetteurs polymériques ponctuels, les Pdots, peuvent alors être suivis dans des environnements biologiques de façon à encoder une information chimique dans un signal de fluorescence bimodal (Figure 2.17). La distance entre les monomères et l’indicateurs de pH est particulièrement adaptées à ces échanges énergétiques puisque la structure polymérique est en elle-même fluorescente et la fluorescéine se retrouve directement à sa surface.

29

Figure 2.17 : A) Représentation schématique de l’assemblage FRET dans des polymères fluorescents (donneur) permettant l’incorporation d’isothiocyanate de fluorescéine (accepteur). B) Dépendance ratiométrique de l’intensité de luminescence en fonction du pH d’une solution. Illustration du marquage cellulaire et de la récolte du signal des bandes de l’architecture FRET avec deux filtres de microscopie

appropriés (λexc = 405 nm; C) λem = 433-444 nm et D) λem = 507-518 nm).63

Malgré la composition exotique des Pdots, à l’origine, les premières nanoparticules sensibles ont été développées autour de la chimie des silanes et des réseaux de silice.10 _{Une molécule fluorescente modifiée}

peut être placée covalemment dans le volume d’une architecture et donc confinée dans des dimensions nanométriques pour sonder un environnement à proximité de manière non-invasive. Les travaux de Burns

et al. ont permis de démontrer plusieurs avantages à ces particules dans un contexte analytique.64 _Par

exemple, l’utilisation de systèmes cœur-coquille silice-sur-silice permet de protéger plus efficacement un fluorophore des effets de son environnement dans un cœur peu poreux et donc d’obtenir une référence interne à des fins de normalisation (Figure 2.18). Les deux bandes d’émission de luminescence proviennent alors de deux espèces différentes, avec des propriétés différentes, dans deux environnements différents, mais sur un même point en suspension. Ce genre de suivi est donc approprié pour la visualisation de signaux en microscopie de fluorescence dans des conditions biologiques. Le signal est principalement limité à l’espace intracellulaire, à cause du régime de taille des nano-objets utilisé. La mesure perçue pour les capteurs de pH demeure toutefois utile : après l’internalisation cellulaire d’objets externes, ceux-ci sont placés dans des vésicules s’acidifiant graduellement pour permettre leur dégradation. Les apparences

30

peuvent être trompeuses dans certains cas car le capteur est bel et bien positionné à l’intérieur de la cellule et rapporte une valeur quantitative du pH, mais la mesure n’est pas caractéristique du métabolisme cellulaire ou de ses organelles. L’action de sonder ces rapporteurs dans un environnement biologique vient plutôt donner des informations sur la réponse cellulaire à l’intrusion des objets, qui sont alors toujours séparés du cytosol par une bicouche phospholipidique.

Figure 2.18 : A) Illustration schématique d’une particule cœur-coquille SiO2@SiO2 incorporant une

molécule sensible et une autre à titre de référence dans la même architecture. B) Graphe de photoluminescence d’une espèce sensible au pH (fluorescéine, FITC) et d’une référence

(tétraméthylrhodamine, TRITC) incorporées dans une particule concentrique. C) Données ratiométriques de luminescence en fonction du pH pour une correction FITC/TRITC. D) Application en imagerie des

valeurs quantitative de pH dans une cellule leucocyte basophile de rat (RBL-2H3).64

D’autres systèmes concentriques ont plutôt appliqué cette méthode de normalisation avec deux émetteurs indépendants pour produire des capteurs quantitatifs de pH. En effet, l’immobilisation de plusieurs espèces fluorescentes dans une même matrice polymérique favorise des transferts énergétiques qui complexifient la corrélation des intensités de fluorescence en fonction d’une variation environnementale. Acquah et al. ont donc développé un assemblage en nano-framboise en apparence similaire à celui montré ci-haut (Figure 2.19), où un cœur-référence (RBiTC) supporte les rapporteurs sensibles au pH (HPTS).65 _{Toutefois, cette}

31

démonstration cherche plutôt à immobiliser différentes populations de particules cœur-coquille SiO2@SiO2

de façon à les séparer pour minimiser les échanges FRET. Ainsi, une ratiométrie devient possible avec les signaux de HPTS et des rhodamines; les auteurs rapportent par contre une certaine dispersité dans les rapports d’intensité selon le nombre de particules sensibles au pH immobilisées par architecture. Ce genre de marqueur assemblé est alors plutôt approprié pour des mesures générales en suspension et apporte des informations seulement qualitatives à l’échelle de capteurs uniques sur des surfaces.

Figure 2.19 : Schéma de préparation de nano-assemblages de systèmes cœur-coquille de silice incorporant une espèce sensible au pH (HPTS) et une référence interne (RBiTC) de façon à minimiser les

échanges FRET dans le spectre récolté.65

Les architectures de silice peuvent aussi être adaptées en fonction d’autres analytes d’intérêt biologique. Par exemple, Baù et al. ont protégé la fluorescéine dans une particule de silice à titre de référence interne pour un dérivé de la quinoline placé en surface pour la détection ratiométrique d’anions chlorure, un élément utilisé dans les cellules excitables pour désensibiliser le potentiel membranaire au repos.66 _{Nommé NanoChlor, cet}

assemblage se veut donc un rapporteur intracellulaire de l’extinction dynamique de la fluorescence en présence de Cl- _{(Figure 2.19). Cette méthodologie de détection par perte de signal bénéficie de}

l’incorporation d’une molécule sensible et d’un étalon interne dans le même système nanométrique puisque plusieurs effets interférents peuvent provoquer une diminution similaire de la fluorescence. À l’échelle moléculaire, ces rapporteurs quinolinium sont aussi particulièrement influencés par la densité optique de leur environnement, du photoblanchiment et de l’auto-absorption.67 _{Ici, ces phénomènes provoquent la diminution}

du signal analytique de la référence de façon similaire à celui du dérivé de la quinoline et sont donc corrigés par le procédé de normalisation ratiométrique. La particule fluorescente peut aussi être fonctionnalisée par des chaînes polyéthylène glycol limitant les interactions d’encrassement biologique et favorisant l’entrée cellulaire par diffusion passive. Ce genre d’architectures multifonctionnelles ouvre alors la porte à des

32

preuves de concept plus poussées que la simple démonstration contrôlée en cuvette. Les auteurs ont fait l’étude de leur capteur dans des environnements biologiques et en ont tiré des données quantitatives quant à la teneur en ions chlorure intracellulaires, comparativement à des mesures à l’aide d’un capteur sur papier. Toutefois, comme plusieurs autres chercheurs ayant fait l’application de capteurs sensibles au pH dans de telles conditions, une méthode d’étalonnage appropriée demeure nécessaire : afin de limiter les interférences en milieu complexe, la solution de culture doit être utilisée plutôt qu’un simple tampon modèle.

Figure 2.20 : A) Structure de l’assemblage NanoChlor incorporant la fluorescéine comme référence interne et un dérivé quinolinium pour la détection des ions halogénure. B) Spectres d’absorption et d’émission en

fonction de la concentration d’ions extincteurs en solution aqueuse. C) Réponse ratiométrique en fluorescence par normalisation du signal du quinolinium par celui de la fluorescéine dans l’architecture.66

Il est important de noter que la protection des fluorophores dans les couches de silice ou dans les MOFs corrige principalement les effets de matrice et d’extinction dynamique du signal : la normalisation est dépendante de l’intensité totale du signal perçu et du photoblanchiment des deux espèces utilisées. L’observation de phénomènes biologiques ne requiert que l’acquisition d’images à des temps donnés plutôt qu’une exposition continue à une lumière incidente; ces architectures fluorescentes demeurent donc intéressantes pour l’imagerie sur environ quelques minutes. Dans ce sens, les architectures pH- et iono- sensibles illustrées auparavant pourraient bénéficier d’une optimisation instrumentale minimisant cette influence analytique sur leurs performances, ou de l’amélioration de leurs propriétés de luminescence par une interaction énergétique complémentaire.

33