Structure de particules pré-ribosomiques

La MET couplée à l’analyse d’images constitue donc une méthodologie de choix pour l’étude de complexes macromoléculaires présentant une hétérogénéité structurale. Cette technique a aussi permis de grandes avancés dans l’étude de la maturation des particules pré- ribosomiques. En effet, chez les procaryotes, cette approche couplée avec la spectrométrie de masse a permis de déterminer la structure 3D de 14 intermédiaires de maturation de la petite sous-unité 30S reconstituée in vitro. Ceci a montré que le corps et la plateforme de ce complexe se forment avant que le domaine de la tête ne soit assemblé (Mulder et al., 2010) (Figure 16).

Une étude plus récente utilisant également la cryo-MET 3D a permis de disséquer l’assemblage de la petite sous-unité 30S in vivo. Cinq conformations différentes de la particule pré-30S ont pu être identifiées en l'absence du co-facteur RimM, ce qui souligne l’implication de cette protéine dans la formation de la tête de la particule et la stabilisation de la structure tertiaire de l’ARNr (Guo et al., 2012).

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Figure 16: Voies parallèles et assemblage séquentiel de la petite sous-unité chez les procaryotes, in vitro.

(D’après Mulder et al., 2010)

En parallèle, l’étude structurale de la biogenèse des ribosomes chez la levure a aussi fortement progressé ces dernières années. En effet, la reconstruction 3D d’une particule pré- 60S reconstituée correspondant à l’interaction entre le complexe 60S et Arx1, Rei1 et Jij1 a été calculée à une résolution de 8.1Å (Greber et al., 2012). Les protéines Rei1 et Jij1 impliquées dans le recyclage d’Arx1 interagissent avec le complexe 60S à proximité d’Arx1 et forment un réseau d’interaction (Figure 17).

Figure 17: Visualisation du réseau d’interaction formé par les co-facteurs Arx1, Jij1 et Rei1. (a) Structure

de la particule pré-60S reconstituée. Les co-facteurs Arx1, Jij1 et Rei1 sont indiqués en rouge, orange et vert respectivement. (b) Jij1 interagit avec Arx1 et Rei1 et est aussi en contact avec Rpl31 indiquée en violet (d’après Greber et al., 2012).

De plus, un précurseur de la grande sous-unité ribosomique a été purifié en utilisant le co-facteur Arx1 comme appât. La structure de cette particule pré-60S a été déterminée par cryo-MET à une résolution de 11.9Å (Bradatsch et al., 2012). Ces travaux ont montré qu’Arx1 se fixe au niveau de sortie de tunnel en contact direct avec le segment d’expansion

72 ES27. Cette particule contient, en plus d’Arx1, d’autres co-facteurs de maturation, ceux-ci empêcheraient le recrutement prématuré des facteurs associés au ribosome au cours de la traduction. Des hypothèses sur la position de ces co-facteurs ont été émises (Figure 18).

Figure 18:Visualisation de co-facteurs de maturation sur un précurseur de la grande sous-unité chez la levure. Ajustement de la structure cristallographique de la particule 60S mature dans la structure de la

particule pré-60S purifiée via Arx1 obtenu par cryo-MET. les densités supplémentaires correspondantes à ces protéines sont indiquées en jaune ; cyan ; bleu, vert, violet, orange et rouge. La position potentielle de certains co-facteurs est montré par une flèche (Adaptée de Bradatsch et al., 2012)

Plus récemment, la structure 3D de cette même particule pré-60S a été déterminée à une résolution de 8,7 Å (Leidig et al., 2014). Il s’agit, à ce jour, de la meilleure résolution obtenue pour une reconstruction 3D de particule pré-ribosomiques chez les eucaryotes. Le positionnement sur le complexe pré-60S de protéines ribosomiques : Rpl7, Rpl24 et des co- facteurs de maturation Mrt4, Nog1, Rsa4 et Arx1 ainsi que du facteur d’initiation eIF6, a été déterminé sans ambiguïté. Ces travaux ont de plus montré que la position du sous-complexe composé par l’ARNr 5S, Rpl5 et Rpl11 ne possède pas la même position dans la particule pré-60S comparé à la grande sous-unité. Celle-ci subit une rotation d’environ 180 degrés dans la particule pré-60S. Cette position non mature est accompagnée d’un réarrangement complet des hélices (82 à 88) d’ARNr formant la protubérance centrale ainsi que de l’hélice 38 (Figure 19). Ceci permettrait de rendre des sites de fixation accessibles à certains co-facteurs impliqués dans la maturation des précurseurs de la grande sous-unité. Par ailleurs, une étude structurale montre que la snoRNP 5S (constituée de l’ARNr 5S, des protéines Rpl5 et Rpl11)

73 est recrutée sur la particule pré-60S via le complexe Rpf2-Rrs1. De plus, ces travaux confirment que la snoRNP 5S ne possède pas sa position finale dans la particule pré-60S lors de son incorporation (Madru et al., 2015).

Figure 19: Différences structuraux entre la grande sous-unité mature et la particule pré-60S. (a) Comparaison de la position de l’ARNr5S dans la particule mature 60S (en gris) et dans la particule pré-60S (en rouge). (b) Visualisation de l’hélice 38 (en orange) et des hélices (82-88) de l’ARNr formant la protubérance centrale dans la particule mature et en cours de formation (adaptée de Leidig et al. , 2014).

Concernant la petite sous-unité ribosomique, la reconstruction 3D d’un précurseur cytoplasmique intermédiaire de la petite sous-unité à un stade de maturation tardif a été calculée à 18Å de résolution. Cette analyse structurale indique que la localisation des co- facteurs sur ce complexe empêche l’entrée en traduction des particules non matures (Figure

20) (Strunk et al., 2011). La résolution obtenue pour cette structure 3D est plus faible que

celle obtenue pour les reconstructions 3D des précurseurs de la grande sous-unité. Ceci pourrait notamment s'expliquer par la grande flexibilité de la petite sous-unité ribosomique (cf. discussion).

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Figure 20: Position des sept co-facteurs de maturation sur la particule pré-40S cytoplasmique de levure.

Les sites de fixation de facteur d’initiation sont masqués par la présence de co-facteurs de maturation. (d’après Strunk et al., 2011).

Chez l’Homme, la purification des particules pré-ribosomiques a longtemps constitué un obstacle majeur à leur études par MET. Ainsi aucune structure 3D, que ce soit de complexes pré-60S ou pré-40S n’a pu être résolue jusqu’à présent chez l'humain.

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