Rôle de RACK1 dans la biogenèse de la petite sous-unité ribosomique humaine

La détermination de la structure 3D des particules LTV1 à 19 Å de résolution nous a permis de confirmer la présence de RACK1 sur ces particules pré-40S cytoplasmiques intermédiaires. Ces données structurales nous ont incités à analyser plus avant le rôle de

142 RACK1 dans l'assemblage de la petite sous-unité ribosomique humaine. Pour cela, un ensemble d'expériences fonctionnelles a été réalisé dans l'équipe, par Lola Deveaux et Nathalie Montel-Lehry, sous la direction de Marie-Françoise O'Donohue. Les résultats de ces analyses sont résumés ci-après.

IV.1- RACK1 est associée aux particules pré-40S dans le noyau

RACK1 est présent dans des particules pré-40S purifiées en utilisant la protéine NOC4, protéine uniquement nucléaire, comme appât (Wyler et al., 2011), ce qui suggère que RACK1 est associée aux particules pré-40S nucléaires. La présence de RACK1 dans le noyau a été mise en évidence par plusieurs travaux, principalement basés sur des données fonctionnelles et sur des données de localisation. Les expériences d'immunofluorescence que nous avons menées indiquent que RACK1 ne s'accumule pas dans le nucléole, et que cette protéine est majoritairement localisée dans le cytoplasme, comme attendu pour une protéine ribosomique (Figure 54).

Figure 55 : Localisation intracellulaire de RACK1 visualisé par immunofluorescence.

Les cellules contrôle ou traité pendant 48h avec chacun des siARN ont été fixées puis la protéine RACK1 a été immnuolocalisée. La barre d'échelle correspond à 10µm

143 IV.2- RACK1 est requise pour une maturation efficace du pré-ARNr 18S-E

Afin de caractériser l'implication de RACK1 dans la maturation de l'ARNr 18S, le patron des pré-ARNr a été analysé après la perte d'expression de RACK1 induite avec 3 siRNA différents. Nous avons vérifié par qRT_PCR que le niveau d'ARNm de RACK1 était réduit à 5-15% du niveau normal par ces siRNA. Les précurseurs des ARNr produits après 48h de traitement avec les siRNA ont été révélés par northern blot avec des sondes dirigés contre les espaceurs transcrits du pré-ARNr (Figure 55).

Ces analyses montrent que la perte d'expression de RACK1 entraîne une accumulation du pré-ARNr 18S-E, ce qui traduit un défaut ou un retard de la formation de l'extrémité 3' de l'ARNr 18S. Les niveaux de précurseurs des ARNr de la grande sous-unité ne semblent pas affectés par la déplétion de RACK1 (FigureNB). Ces résultats indiquent que RACK1 est nécessaire pour une maturation optimale de l'ARNr 18S.

Pour distinguer si l'accumulation du précurseur 18S-E était liée à un défaut de maturation ou à un retard d'export, des expériences de fractionnement noyau / cytoplasme menées après la perte d'expression de RACK1 et les ARN ont été analysé dans chacune des fractions (Figure 56a). Le pré-ARNr 18S-E s'accumule fortement dans le cytoplasme, ce qui indique un défaut dans la conversion du pré-ANRr 18S-E en ARNr 18S mature. Il semble être plus abondant dans le noyau par comparaison aux cellules contrôles, ce qui pourrait traduire également un retard dans l'export de ce pré-rRNA. Cependant, ce phénotype est moins prononcé que dans le cas de cellules n'exprimant plus RPS15, qui est nécessaire pour rendre les particules pré-40S compétentes pour leur export nucléaire (Léger-Silvestre et al., 2004). Ces données ont été complétées par la détection des ARN précurseurs de l'ARNr 18S par FISH en utilisant une sonde contre l'extrémité 5' de l'ITS1 (Figure 56b). Le signal de fluorescence augmente fortement dans le cytoplasme après la perte d'expression de RACK1, ce qui confirme les données de fractionnement subcellulaire.

144

Figure 56 Analyse par nothern blot des précurseurs de l’ARNr après 48h de traitement avec des siRNA contre l'ARNm RACK1

Les ARN extraits de cellules traitées avec des siRNA contre RACK1, RPS15 et RPS24 ont été analysés avec des sondes s'hybridant à l'ITS1 ou à l'ITS2. Les cellules traitées avec les 3 siRNA contre RACK1 présentent principalement une accumulation de l'ARN 18S-E. Une augmentation de la quantité d'ARN 26S et 43S est également observées, mais n'est pas observées de manière reproductible (non montré). La perte d'expression de RPS15 et de RPS24 se traduisent respectivement par l'accumulation des pre-ARNr18S-E et 30S, comme déjà observé précédemment (Rouquette et al., 2005; Choesmel et al., 2008).

145

Figure 57: Localisation intracellulaire des précurseurs de l'ARNr 18S : fractionnement subcellulaire et hybridation in situ. (a) Les fraction cytoplasmique et nucléaire de cellule témoins ou traitée à l'aide des

différents si ARN pendant 48h ont été isole et les ARN en ont été extraits. Apres séparation par électrophorèse sur un gel d'agarose 1,2 %, transfert sur une membrane de nylon puis révélation avec une sonde 5'ITS radiomarquée, les précurseurs de l'ARNr 18S ont été identifiés dans chacune des fractions. Total : ARN totaux avant fractionnement; cyto : ARNs totaux de la fraction cytoplasmique ; noyau : ARNs totaux de la fraction nucléaire. (b) En parallèle, les précurseurs de l’ARNr 18S ont été localisés in situ grâce à la même sonde couplée à une molécule fluorescente (5'ITS-Cy3). Les noyaux ont été colorés au Hoechst 33342. Les images ont été prises avec le même temps de pause et ont été traitées pour l'affichage de manière identique.

a)

146 IV.3- RACK1 n'est pas strictement requis pour l'assemblage de la petite sous-unité ribosomique

Afin d'évaluer l'impact du retard de maturation du pré-ARNr 18S-E observé après traitement avec des siRNA RACK1 sur l'accumulation de la sous-unité 40S, nous avons analysé sur gradient de saccharose les ribosomes des extraits cellulaires cytoplasmiques après 48h de déplétion de RACK1 (Figure 57). Nous n'observons pas de déséquilibre majeur entre la grande et la petite sous-unité ribosomique. En comparaison, la perte d'expression de RPS26 entraine une accumulation de sous-unités 60S libres par rapport aux sous-unités 40S libres et une baisse drastique de ribosomes 80S matures, ce qui est caractéristique d'un défaut de synthèse de la petite sous-unité ribosomique.

Cependant, la perte d'expresion de RACK1 entraîne une baisse de la quantité des sous- unités 40S et 60S libres, une augmentation significative du nombre de monosomes 80S et une diminution de la fraction des polysomes, ce qui suggère que RACK1 est requise globalement pour la traduction (Figure 57). Ce phénotype est à rapprocher de la perte d'expression de RPS25. La perte d'expression de toutes les autres protéines RPS entrainent un défaut drastique de production de l'ARN 18S (O'Donohue, 2010).

L'ensemble de ces résultats indiquent que RACK1 est requise pour la maturation normale de l'extrémité 3' de l'ARNr 18S. Elle pourrait en outre être impliquée dans un mécanisme global de régulation de la traduction.

147

Figure 58: Analyse des ribosomes sur gradient de saccharose après déplétion de RACK1.

Après 48h de traitement avec les siRNA dirigés contre RACK1 ou RPS26, les fractions cytoplasmiques des cellules ont été extraites et ultracentrifugées sur un gradient de saccharose 10-50 %. (A). Les profils obtenus ont été comparés afin de déterminer l'effet de la perte d'expression des protéines (RACK1 ou RPS26) sur la formation des sous-unités 40S et 60S, de la particule 80S et des polysomes. (B) Les profils polysomiques ont été superposés afin de mieux voir l'effet de la déplétion de RACK1 sur la formation des particules ribosomiques.

148