La particule pré-40S tardive RIO1(KD)

IV.1- L'analyse de la particule tardive RIO1(KD) révèle de nouvelles différences de maturation de la petite sous-unité 40S entre l'Homme et la levure

Le co-facteur RIO1 est une ATPase qui possède dans son site catalytique un acide aspartique, correspondant à l’acide aminé 244 chez la levure et 324 chez l’Homme. Lorsqu’on remplace cet acide aminé par une alanine, la protéine est alors incapable d’hydrolyser l’ATP (Ferreira-Cerca et al., 2014 ; Widmann et al., 2012). Chez la levure, le co-facteur Rio1 ainsi muté est majoritairement associé à des particules pseudo-80S ( Ferreira-Cerca et al., 2014). La particule pseudo-80S correspond à l’association de la particule pré-40S avec la grande sous-unité et représente une étape tardive dans la maturation de la petite sous-unité (cf introduction). En parallèle, des travaux ont montré que la forme native de la protéine Rio1 interagit avec des particules pré-40S mais aussi avec des particules pseudo-80S (Turowski et

al., 2014 ; Ferreira-Cerca et al., 2014). Dans ce cas, environ 55 % des particules associées au

177 Chez l’Homme, si la forme native de RIO1 s'associe de façon très dynamique avec la particule pré-40S, elle est stablement associée au complexe formé par les protéines PRMT5 (Protein Arginin MethylTransferase 5) et MEP50/WD45, aussi appelé méthylosome. Associé au méthylosome, RIO1 jouerait un rôle d’adaptateur et permettrait le recrutement de la nucléoline pour sa méthylation par PRMT5 (Guderian et al., 2011 ; Widmann et al., 2012). En revanche, lorsque son activité enzymatique est inactivée, Rio1(KD) est alors stablement associé à des particules pré-40S tardives. Ces précurseurs tardifs, purifiés en utilisant RIO1(KD) comme appât, sont composés du pré-ARNr 18S-E, de toutes les RPS et de trois co-facteurs de maturation qui sont RIO1(KD), DIM2 et NOB1. L’activité enzymatique de RIO1 étant essentielle au clivage du pré-ARNr 18S-E et au relargage de DIM2 et NOB1, les particules RIO1(KD) sont bloquées à un stade de maturation juste avant le clivage au site 3 du pré-ARNr. (Widmann et al., 2012).

L'ensemble de nos données révèle une différence massive dans la maturation de la particule pré-40S humaine par rapport à la levure. En effet, chez l'Homme, aucune RPL n’a été détectée dans les particules RIO1(KD) par spectrométrie de masse. Dans cette même étude, l'analyse de l'extrait total sur gradient de sucrose démontre que la protéine RIO1(KD) est seulement présente dans la fraction correspondant aux particules pré-40S (Widmann et al., 2012). Par ailleurs, l'observation par cryo-MET montre que les particules RIO1(KD) présentent un seul type de morphologie dont la forme et les dimensions sont similaires à la petite sous-unité mature. Ainsi chez l’Homme, la protéine RIO1 mutée est associée uniquement à des particules pré-40S, et non à des particules pseudo-80S comme cela a été montré chez la levure. Seule l'observation de particules globulaires purifiées grâce à l'étiquetage de DIM2 suggère l’existence des particules pseudo-80S chez l’Homme. Si ce résultat se confirme, nos données montreraient que la cinétique de formation des particules pseudo-80S est différente chez l’Homme et la levure, et que RIO1 n'interviendrait pas dans la maturation de la petite sous-unité de la même façon ou au même moment.

178 IV.2- Structure de la particule pré-40S tardive

La structure 3D des particules pré-40S RIO1(KD) représente la première reconstruction 3D de précurseur de la petite sous-unité ribosomique à un stade tardif de maturation. L’observation des sections de la structure 3D des particules pré-40S tardives RIO1(KD) montre que, de même que la particule intermédiaire LTV1, les domaines du bec et de la plateforme présentent de la flexibilité. Cependant, le corps des particules RIO1(KD) est mieux défini que celui des particules LTV1. Ceci peut s'expliquer soit par le fait qu’il y aurait une stabilisation de la structure des particules pré-40S aux cours de leurs maturation ; soit par le traitement à la glutaraldéhyde qu’ont subi les particules pré-40S tardives dans le but de diminuer leur flexibilité. La comparaison de la structure 3D des particules RIO1(KD) avec celle de la petite sous-unité mature, par le calcul d'une carte de différences, a permis de souligner des densités supplémentaires chez la particule pré-40S, témoins de la présence des co-facteurs de maturation RIO1(KD), NOB1 et DIM2. En outre, la carte de différence révèle des densités additionnelles clairsemées sur la tête et le bec des particules RIO1(KD). Ceci pourrait suggérer que la tête de la particule n’aurait pas encore adopté sa position finale dans les particules pré-40S.

L’attribution des densités correspondant aux co-facteurs sur les particules RIO1(KD) a été effectuée en se basant sur les données de CRAC obtenues chez la levure (Figure 63). En effet, celles-ci ont permis de déterminer le site d’interaction de Rio1 avec l’ARNr 18S, qui se situe en haut de l’hélice 44 (Turowski et al., 2014). La présence d’une densité additionnelle au niveau du haut de l’hélice 44 sur la structure 3D des particules humaines RIO1(KD) semble bien correspondre à la présence de RIO1. De même, le co-facteur Dim2 possède des sites d’interaction avec l’ARNr 18S présents sur les hélices 24, 28 et 45 qui sont localisés au niveau du haut de la plateforme et de l'arrière de la tête de la particule pré-40S (Turowski et

al., 2014). Au vu de ces sites de fixation avec l’ARNr 18S de Dim2, la densité supplémentaire

localisée dans le sillon de l’ARNm pourrait correspondre à la présence de cette protéine. De plus, cette densité additionnelle présente dans le sillon de l’ARNm a aussi été observée sur les structures des particules purifiées en étiquetant DIM2 (déterminées par Ramtin Shayan lors de son stage M2 dans notre équipe). Une petite densité supplémentaire est présente au niveau de la plateforme et pourraient correspondre à la présence de NOB1. Cependant, la structure de ce co-facteur n’a pu être ajustée de façon réaliste dans ces densités supplémentaires.

179 La taille des densités supplémentaire assignées aux cofacteurs RIO1 et DIM2 permet un ajustement correct des structures de ces co-facteurs par rigid body docking à l’aide de CHIMERA. Cependant, toutes les structures existantes correspondent à des protéines plus petites que les protéines humaines pleine taille.

- pour RIO1, la structure, déterminée par cristallographie, est celle d’un fragment de RIO1 humain comprenant les acides aminés 143-494, incluant le domaine RIO kinase et les 106 acides aminés de l’extrémité C-terminale. La boucle correspondant aux acides aminés 212- 243 n’a pas être observée, du fait de sa flexibilité ( Ferreira-Cerca et al., 2014). Ainsi, ce fragment de RIO1 contient 320 acides aminés alors que la protéine entière en contient 568. - La structure 3D de DIM2 a été résolue chez l’archébactérie P. horikoshii, elle inclut uniquement 219 acides aminés (Jia et al., 2007 ). Chez l’Homme, ce co-facteur est formé de 252 acides aminés.

- De même, la structure 3D de NOB1 a été déterminée chez P. horikoshii. Cette protéine contient seulement 147 acides aminés correspondant au cœur fonctionnel de cette endonucléase. La protéine humaine est composée de 412 acides aminés.

Nos résultats de rigid body docking sont donc à prendre en considération avec précaution. Cette conclusion s’applique aussi pour les résultats de rigid body fitting obtenus chez la particule LTV1.

Figure 65: Modèle de positionnement des co-facteurs pour la particule pré-40S RIO1(KD) purifiée à un stade de sa maturation tardif chez l’Homme

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C- Comparaison des structures obtenues : modèle de transition structurale