Mise en place des outils requis pour l’étude

I- Choix des particules pré-40S humaines

L'équipe du Pr. Ulrike Kutay dispose d'outils pour purifier des particules pré-40S à différentes étapes de leur maturation. Afin de déterminer quelles particules étaient les plus adaptées à une étude structurale par cryo-MET 3D, nous avons dans un premier temps observé cinq types de particules purifiées grâce à l'étiquetage des co-facteurs de maturation suivants : C21ORF70, ENP1, DIM2, LTV1 et RIO1(KD) (catalytiquement inactif). Le co- facteur C21ORF70 est associé uniquement aux particules pré-40S nucléaires ; ainsi, la purification d'affinité par cette protéine ne devrait permettre d'obtenir que des particules pré- 40S nucléaires (Figure 31). La protéine ENP1 s’associe à la particule pré-40S dans le nucléole, s'en dissocie dans le cytoplasme après l'étape dite intermédiaire. Cet appât de purification devrait donc générer un mélange de particules pré-40S nucléaires et cytoplasmiques (Figure 31). De même, DIM2 s’associe aux précurseurs de petite sous-unité dans le nucléole, et serait l'un des derniers co-facteurs de maturation à s'en dissocier dans le cytoplasme. LTV1 est retrouvé majoritairement associé aux particules pré-40S dans le cytoplasme, mais est également présent dans le noyau (Figure 31). L'utilisation de ce co- facteur comme appât de maturation devrait donc générer un mélange de particules nucléaires et cytoplasmiques, avec une majorité de ces dernières. Enfin, si l'on utilise comme appât de purification une forme mutante de RIO1, dont l'activité kinase est supprimée, on obtient des particules pré-40S bloquées à l'étape dite tardive de leur maturation. (Figure 31).

Figure 31: Modèle de la maturation de la petite sous-unité chez l’Homme.

Les protéines utilisées comme appât pour la purification d’affinité des particules pré-40S sont indiqués en rose pour les co-facteurs C21ORF70, en violet DIM2, en vert LTV1, et en magenta RIO1(KD).

108 La composition protéique des précurseurs de la petite sous-unité purifiés a été déterminée dans des études précédentes par l’équipe du Pr. Ulrike Kutay, par western blot et spectrométrie de masse (Wyler et al., 2011 ; Widmann et al., 2012 ; Zemp et al., 2014). Les résultats publiés de ces études sont rappelés dans les Figures 32 et 33 ci-dessous.

Figure 32: Etude de la composition protéique des particules pré-40S disponibles par western blot. a) Analyse par western blot des particules purifiées en utilisant comme appât DIM2, ENP1, LTV1 (encadré en violet) (D’après Wyler et al., 2011).b) Analyse par western blot des particules pré-40S en étiquetant C21ORF70 (encadré en bleu) (D’après Zemp et al., 2014). c) Analyse par western blot des particules purifiées en utilisant comme appât RIO1(KD) (encadré en vert) (D’après Widmann et al., 2012).

Figure 33: Détermination de la composition des particules pré-40S purifiées en utilisant comme appât

LTV1 (a) (D’après Wyler et al., 2011) ; C21ORF70 (b) (D’après Zemp et al., 2014) et RIO1(KD) (c) (D’après Widmann et al., 2012)

109 La composition en ARNr de particules pré-40S a aussi été déterminée par nothern blot et 3’RACE par Marie-Françoise O’Donohue (Figure 34). Ces résultats indiquent que ces particules contiennent exclusivement du pré-ARN 18S-E dont l’extrémité 3’ a été maturée par une exonucléase, comme attendu des particules principalement cytoplasmiques (Preti et al., 2013). Les particules LTV1 sont constituées du pré-ARNr 18S-E dont l’extrémité comprend 5 à 35 nucléotides.

Figure 34 : Composition en ARNr des particules pré-40S purifiées en étiquetant soit LTV1, ENP1 ou DIM2. a) Analyse des ARNr contenus dans les particules LTV1, ENP1 et DIM2 par nothern blot. Ces

précurseurs de la petite sous-unité sont constitués du pré-ARNr 18 S-E (Marie Françoise O’Donohue).b) Etude de l’extrémité 3’ du pré-ARNr constituant les particules LTV1 par des expériences de 3’RACE. Les particules LTV1 présentent pré-ARNr dont l’extrémité 3’ comprend entre 5 et 35 nucléotides de l’ITS1. Des extrémités plus courtes ne peuvent pas être détectées dans cette expérience

A l'issue de leur purification, la concentration en ARN des solutions contenant les différentes particules pré-40S est mesurée grâce à un nanodrop. Celle-ci varie typiquement entre 25 ng.µl-1 et 70 ng.µl-1 (Tableau 3). Le rendement de purification des particules RIO1(KD) est plus faible que les autres. Ceci s’explique notamment par la stratégie de purification employée : on isole ici des particules pré-40S associées à une protéine mutante, bloquées à un stade tardif de maturation (cf matériel et méthode).

Extrémité ITS1 (nb nucléotides) 35 17 16 15 9 8 7 5 nb séquences _{10 1 1 3 6 20 10 1} % extrémités séquencées 19,2 1,9 1,9 5,8 11,5 38,5 19,2 1,9

a)

b)

110 Nous avons vérifié si ces différentes particules étaient utilisables pour une analyse structurale en cryo-MET. Pour cela, les différents complexes ont été observés par MET après coloration négative, à une concentration de 10 ng.µl-1. Pour chacune de ces particules pré- 40S, la morphologie des complexes et la monodispersité des échantillons ont été inspectées. Des images typiques en coloration négative sont présentées dans la Figure 35. En général, toutes les solutions observées révèlent des particules « isolées » sur les grilles, mais également une forte propension à former des agrégats. Dans l'ensemble, ces préparations présentent un degré de monodispersité en adéquation avec une étude structurale par cryo- MET 3D.

Une analyse visuelle montre que les préparations purifiées en utilisant C21ORF70, ENP1 et DIM2 comme appât présentent des particules ayant plusieurs types de morphologies. Pour les particules purifiées par DIM2 et par C21ORF70, on peut distinguer deux types de particules, l’une ayant une forme globulaire, avec des dimensions similaires à celle d'une particule 80S mature (30 nm de diamètre), et l’autre ayant une forme allongée, similaire à la petite sous-unité mature en terme de taille et de morphologie. Pour les particules ENP1, on trouve ces deux types de morphologies, mais également un troisième type de particules, avec une forme en « collier de perles ».

Les précurseurs de la petite sous-unité purifiés en utilisant LTV1 ou RIO1(KD) comme appât ne présentent qu'un seul type de particules, dont les dimensions et la forme allongée est très proche de celle des petites sous-unités ribosomiques matures.

Ces derniers échantillons paraissent les plus simples à caractériser d’un point de vue structural. Nous avons donc focalisé nos travaux sur l'analyse des particules purifiées par LTV1 et RIO1(KD) étiquetés. Les particules purifiées en étiquetant HASt-LTV1 et RIO1(KD)-StHA seront nommées particules LTV1 et RIO1(KD) respectivement dans la suite du manuscrit.