Analyse de la structure obtenue

Afin d'analyser la structure 3D de particules pré-40S tardives obtenue ci-dessus, comme pour la structure des particules pré-40S cytoplasmiques intermédiaires, nous l'avons comparée à celle de la petite sous-unité ribosomique mature humaine (Anger et al., 2013, pdb accession code : 4V6X) (Figure 61a et b).

Pour ce faire, la structure 3D de la petite sous-unité mature a été filtrée à 19 Å de résolution et ajustée dans la carte de densité électronique de la particule pré-40S tardive par rigid body docking à l’aide de la commande « fit in map » du logiciel CHIMERA.

Cette comparaison a permis de confirmer que toutes les RPS présentes à ce stade de maturation peuvent être accommodées dans la carte de densité électronique de la particule pré-40S tardive sans réarrangement majeur. En particulier, la densité formant l'oreille de la tête de la particule, et correspondant à la présence de RACK1 est présente sur ces particules pré-40S tardives. Elle est mieux définie que pour les particules pré-40S intermédiaires. Ceci semble indiquer que la position de RACK1 se stabilise au cours de la maturation de la petite sous-unité ribosomique.

Cette première comparaison visuelle montre que si la structure de la particule pré-40S tardive est très similaire à celle de la petite sous-unité ribosomique mature, on peut distinguer des zones de densité supplémentaire sur la particule pré-40S. L'une d'entre elles est localisée entre le bas de la tête et le sillon de l'ARNm, au voisinage du site E de liaison de l'ARNt (côté plateforme). Une autre zone de densité supplémentaire est située sur le haut de l'hélice 44, à proximité du site P de liaison à l'ARNt (Figure 61a et b).

Afin de mieux mettre en évidence les zones de densité supplémentaires de la structure de la pré-40S tardive par rapport à celle de la petite sous-unité mature, nous avons ensuite calculé une carte de différence entre ces deux structures, grâce à la commande « vop subtract » du logiciel CHIMERA. La visualisation de cette carte de différence, présentée dans la Figure 61c ci-après, permet de regrouper les densités supplémentaires en trois grands groupes, selon leur localisation et leur volume :

(1) Du côté de l'interface avec le solvant, au niveau du milieu de la tête, on distingue des densités supplémentaires éparses. Cette observation pourrait indiquer que la tête ne possèderait pas encore sa position finale dans la particule pré-40S. D’autre part, ceci peut être

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le reflet, sur la particule pré-40S tardive, d'un réarrangement structural des constituants de la particule 40S mature, ou bien de la présence de co-facteurs de maturation très flexibles associés à la particule RIO1(KD). De plus, un petit volume est retrouvé au niveau de la plateforme. Pour mémoire, le co-facteur de maturation Nob1 a été localisé sur la plateforme dans la structure de pré-40S de levure purifiée avec Rio2-TAP (Strunk et al., 2011), mais également dans la structure de pré-40S intermédiaire humaine présentée en B. Cette différence de densité, au niveau de la plateforme suggère un réarrangement de la structure de la plateforme entre les étapes de maturation cytoplasmiques intermédiaire et tardive.

(2) Au niveau du bas du corps, des zones de densité supplémentaires de taille moyenne sont retrouvées, l'une entre le pied gauche et le pied droit, et l'autre au niveau du bas de l'hélice ES3S formant le pied gauche de la structure. Il est difficile d'interpréter ce changement structural, qui pourrait, comme pour les phénomènes décrits en (1), correspondre à un réarrangement conformationnel et/ ou à la présence de co-facteurs de maturation. Cependant, à ce jour, aucun co-facteur de maturation n'ayant été localisé dans cette partie de la structure de la sous-unité ribosomique, le changement conformationnel de molécules intrinsèques à la particule 40S mature, semble être l’hypothèse la plus réaliste.

(3) Enfin, la carte de différence présente une masse principale, située du côté de l’interface avec la 60S, au niveau du haut de l'hélice 44, se prolongeant dans le sillon de l'ARNm et se terminant entre la plateforme et la tête de la particule. Les données de CRAC établies chez la levure indiquent que la zone de liaison de Rio1 sur le pré-ARNr 20S est située en haut de l'hélice 44. De la même façon, la zone d'interaction de Dim2 sur le pré-ARNr 20S a été attribuée, chez la levure, à des nucléotides des hélices 24, 28 et 45, situées sur le haut de la plateforme et le bas de l'arrière de la tête, côté interface avec la sous-unité 60S. Ces données indiquent que cette zone de densité supplémentaire pourrait être attribuée à la présence des co-facteurs RIO1 et DIM2.

Afin d'explorer plus avant cette hypothèse, nous avons ajusté dans cette zone de densité supplémentaire les structures atomiques de RIO1 et DIM2 (code d'accession pdb respectifs : 4OTP et 3AEV) par rigid body docking. Nous avons pour cela utilisé la commande « fit in map » du programme CHIMERA. Les résultats de ces essais sont présentés Figure 61d. L'ajustement de ces deux structures au vu de la taille des densités supplémentaires paraît correct ; cependant les structures utilisées sont plus petites que les protéines humaines correspondantes. En outre, nous n'avons pas effectué cette expérience d'ajustement (avec la commande « fit in map ») pour la structure de NOB1, qui est le troisième co-facteur de

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maturation présent sur cette particule tardive. En effet la carte de différence employée révèle une petite densité supplémentaire au niveau de la plateforme, à laquelle on ne peut pas attribuer cette protéine avec confiance.

Figure 63: Comparaison des structures 3D de la particule pré-40S intermédiaires RIO1(KD) et de la sous- unité 40S. En a). Les vues de surface de la structure 3D de la particule pré-40S RIO1(KD) sont représentées en

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RIO1(KD) comparé à la petite sous-unité. En b) les vues correspondantes de la structure 3D de la petite sous- unité ribosomique, filtrée à 19Å sont indiquées en gris. En c) La carte de différence entre les deux structures 3D (particule pré-40S et petite sous-unité filtré à 19Å) est représentée en bleu. Les densités supplémentaires sont indiquées par des flèches (la flèche rouge correspondant à la zone 1, la rose à la zone et la violet la zone 3). En d) Localisation hypothétique des co-facteurs sur la particule pré-40S RIO1(KD). La structure des co-facteurs DIM2, RIO1 sont indiquées en orange, jaune respectivement et ont été ajustées via la commande « fit in map ». Concernant NOB1 en bleu foncé, elle a été placée dans la carte de différence manuellement. La structure 3D de la petite sous-unité filtrée à 19Å de résolution est représentée en gris, les densités supplémentaires apparaissent sont en bleu transparent.

En conclusion, la structure 3D de la particule pré-40S humaine RIO1(KD) a été déterminée à 15Å de résolution. Il s’agit de la meilleure résolution obtenue, jusqu’à présent, pour une reconstruction 3D d’un précurseur de la petite sous-unité particule pré-40S eucaryote. Nous avons pu proposer un modèle de position des co-facteurs sur cette particule en nous basant sur les données de CRAC obtenues chez la levure.

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161 L’objectif de ma thèse était d’étudier l’assemblage cytoplasmique de la petite sous- unité ribosomique humaine. Ces travaux ont permis d’implémenter au laboratoire une approche d’analyse structurale à grande échelle basée sur la cryo-MET et à l’analyse d’images. J'ai ainsi pu déterminer la première structure 3D d'une particule pré-40S humaine. Ceci a permis d’une part de proposer un modèle de positionnement des co-facteurs de maturation sur la particule pré-40S étudiée, d’autre part de souligner une nouvelle divergence dans la formation de la petite sous-unité ribosomique humaine comparé à la levure, au vu de la présence de RACK1 sur les particules pré-40S humaines. Ensuite, j'ai également obtenu la structure tridimensionnelle d’une particule pré-40S à un stade de maturation plus tardif. La comparaison des structures de particules pré-40S obtenues a permis de mettre en évidence la présence de changements conformationnels des précurseurs de la petite sous-unité lors de leur passage d’un état intermédiaire à un état tardif de leur maturation.