Structure des Orai

3.

Nommés ainsi en référence aux gardiens des portes du paradis, les protéines Orai constituent une famille composée de 3 homologues remarquablement conservés chez les mammifères : Orai1, Orai2 et Orai3 (Prakriya and Lewis, 2015).

a. Orai1

La protéine Orai1 est une protéine de 301 aa (33 kDa, bien que le poids moléculaire prédit peut être significativement modifié par des modifications post-traductionnelles, telle qu'une glycosylation sur le résidu Asn223 attribuant à la protéine un poids moléculaire autour de 55 kDa

(Gwack et al., 2007a)). Elle est codée par un gène présent au niveau du chromosome 12 (région 12q24.31).

Un monomère de Orai1 traverse quatre fois la MP et les extrémités C- et N-terminales ainsi que la deuxième boucle sont dans le cytoplasme, exposant les deux autres boucles dans le milieu

extracellulaire. Les deux extrémités N- et C- terminales sont requises pour l'interaction et la régulation de STIM1 aux jonctions entre la membrane du RE et la MP (jonctions RE-MP) (Muik et al., 2009; Palty and Isacoff, 2016). Au niveau de l'extrémité N-terminale, Orai1 présente deux domaines riches l'un en arginine (R) et l'autre en proline (P) le distinguant des autres isoformes d'Orai (Vig et

al., 2006) ainsi qu'un domaine riche en arginine et en lysine (RK) (Figure I.28). Suite aux quatre domaines TM, Orai1 possède un domaine CC en C-terminale, commun aux trois isoformes d'Orai, et dont le rôle est d'intervenir dans les interactions protéiques et notamment avec STIM1 (Cahalan et

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Figure I.28. Structure moléculaire de Orai1. L'extrémité N-terminale inclut des domaines riches en arginine et proline puis en arginine et lysine. Orai1 possède quatres domaines TM. L'extrémité C- terminale inclut 1 région CC. R: Arginine-rich region; P: Proline-rich region; RK: Arginine-lysine-rich region; TM: Transmembrane domain; CC: Coiled-coil domain. Adaptée de (Rosado et al., 2015).

Avant la détermination de la structure cristalline chez la Drosophile, Il semblait que le canal Orai1 humain formait un tétramère avec une grande affinité pour le Ca2+ (Maruyama et al., 2009; Mignen et al., 2008b; Penna et al., 2008). Finalement, la cristallisation de Orai1 chez la Drosophile a identifié une protéine héxamérique perméable au Ca2+ (Hou et al., 2012; Thompson and Shuttleworth, 2013a). Toutefois, les canaux Orai peuvent également former des hétéropentamères (3 Orai1 et 2 Orai3) pour fonctionner comme des canaux ARC, qui sont des canaux indépendants des stocks et régulés par la population de STIM1 située à la MP (Thompson and Shuttleworth, 2013b;

Zhang et al., 2014).

Il semble dorénavant établit que le canal Orai1 comprend six monomères Orai1, arrangés de

manière précise afin de former un canal ionique sélectif au Ca2+ dans la MP. Le pore est formé des six domaines TM1 de chaque monomère Orai1 (Derler et al., 2013a). Le pore agit ainsi comme un entonnoir divisé en quatre régions définies différemment: 1) le filtre de sélectivité qui est formé d'un anneau de résidus glutamate conférant au pore un potentiel électrostatique négatif et permettant

d'attirer le Ca2+, 2) une cavité hydrophobique comprenant les résidus V102, F99 et L95 qui établissent des liaisons de Van der Waals les uns avec les autres, 3) une région basique comprenant les résidus R91, K87 et R83 et 4) une région cytosolique qui s'étend dans le cytosol et qui est appelée ETON (Extended TM1 Orai1 N-terminal region) (Derler et al., 2016) (Figure I.29).

 Le filt e de s le ti it est la pa tie la plus t oite du po e, fo pa la p se e d u sidu glutamate (E106) du domaine TM1 de chaque sous unité, chacun situé à l'extrémité extracellulaire de chaque domaine. La sélectivité au Ca2+ porté par les résidus E106 est complétée par la présence de résidus aspartate négativement chargés dans la première boucle extracellulaire (D110, D112, D114). Le modèle actuellement proposé repose sur le fait que le résidu E106 permet de guider les ions Ca2+ à travers le pore maintenant ainsi la haute sélectivité au Ca2+ des canaux CRAC (Yamashita and Prakriya, 2014).

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 Le résidu valine en position 102 (V102) situé proche de l'entrée externe dans le pore d O ai a t p opos o e fo tio a t o e u e po te h d opho ique permettant le passage des ions (McNally et al., 2009) et constituant une barrière au flux d'ions lorsque le canal Orai1 est en

conformation fermé (Gudlur et al., 2014).

 Le résidu arginine R91 semble former une ouverture électrostatique vers la partie cytosolique du domaine TM1 (Derler et al., 2009; Zhang et al., 2011) et ainsi est important pour l'ouverture du canal. Finalement les trois résidus chargés positivement R91, K87 et R83 fonctionnent

comme une barrière et comme stabilisateurs électrostatiques (Derler et al., 2013a).

 La région ETON contient deux sérines (S90, S89) intercalées entre R91 et K87 pouvant contribuer à la flexibilité des segments successifs N-terminaux et TM1 (Rothberg et al., 2013).

Figure I.29. Structure cristalline de Orai1 chez la Drosophile. a. Deux hélices des domaines TM1 sont dessinées (les 4 autres ne sont pas présentées pour plus de clarté). Les acides aminés tapissant le pore sont représentés en jaune. Les équivalents des résidus de Orai1 chez l'homme sont indiqués entre parenthèse. b. La vue du pore est représentée avec les différentes régions le composant. Adaptée de (Hou et al., 2012).

Deux variants de Orai1, Orai1 et Orai1, peuvent être exprimés. Orai1 est le variant conventionnel dont la structure et les fonctions ont été décrites précédemment, alors que Orai1 constitue un variant plus court résultant en l'expression d'une protéine d'approximativement 23 kDa. En effet, tandis qu'aucun variant d'épissage alternatif n'a encore été décrit pour Orai1, une forme plus courte de Orai1 peut être générée par initiation de la traduction au niveau d'un second site (M64/71) (Fukushima et al., 2012). Dans la forme courte, une séquence polybasique est

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bien que les conséquences fonctionnelles de ce mécanisme soient encore méconnus à ce jour (Fukushima et al., 2012). Les deux va ia ts d O ai o t t d its o e e p i s de a i e ubiquitaire dans des lignées cellulaires humaines provenant de différents tissus, tels que les HEK293,

les Jurkat, les HeLa, les HaCaT épidermales ou la lignée cellulaire de carcinome du foie T84, et avec des localisations similaires (Fukushima et al., 2012). Une étude plus récente a montré que les deux variants Orai1 pouvaient être des sous-unités des canaux CRAC, avec quelques différences

biophysiques incluant une forte inactivation d'Orai1 dépendante du Ca2+ (Desai et al., 2015). Enfin, la différence fonctionnelle la plus significative entre ces deux variants repose sur la participation de

Orai1, mais pas de Orai1, dans les canaux ARC (Desai et al., 2015), bien que les mécanismes moléculaires soulignant la différence significative entre ces deux variants restent encore méconnus.

b. Orai2 et Orai3

Les 2 isoformes Orai2 et Orai3 sont retrouvées chez les vertébrés, où d'ailleurs Orai3

n'apparait ue plus ta di e e t da s l olutio et seule e t hez les a if es. E effet, il semble que Orai3 ait évolué à partir de Orai1 suite à un évènement de duplication génique. Ainsi, en termes d'évolution, Orai1 est le membre le plus ancien de la famille Orai alors que Orai3 est le plus récent (Shuttleworth, 2012).

La protéine Orai2, est une protéine de 254 aa (29 kDa) codée par un gène présent au niveau

du chromoso e gio . alo s ue l isofo e O ai est u e p ot i e de aa kDa codée par un gène présent au niveau du chromosome 16 (région 16p11.2).

Les 3 isoformes Orai possèdent de nombreuses séquences d'homologie les unes avec les

autres (62% d'homologie globale, et jusqu'à 92% dans les domaines TM). Les isoformes Orai2 et Orai3 diffèrent de Orai1 principalement dans leur extrémité C-terminale ainsi que dans la boucle

entre les domaines TM3 et 4. Les trois isoformes génèrent un courant calcique avec des caractéristiques biophysiques similaires au courant CRAC (Gross et al., 2007; Gwack et al., 2007a; Lis et al., 2007) et sont largement retrouvés dans la plupart des tissus (Gross et al., 2007; Gwack et al., 2007a; Wissenbach et al., 2007) mais présentent néanmoins des profils de sélectivité légèrement différents et des différences de rétroaction vis-à-vis du Ca2+ réticulaire (Derler et al., 2016). Cependant, Orai1 reste la protéine la mieux étudiée et l'isoforme prédominante permettant la médiation des SOCEs dans la plupart des lignées cellulaires.

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Ces isoformes participent également à des mécanismes non dépendants des réserves calciques intracellulaires. De ce fait, les protéines Orai1 et Orai3 peuvent également s'assembler en hétéromultimères pour former des canaux dépendants de STIM1 mais indépendants des réserves

calciques intracellulaires qui sont régulés par l'acide arachidonique (Canaux ARC) (Mignen et al., 2008a, 2009; Thompson and Shuttleworth, 2013b) ou par le leucotriène C4 (Canaux LRC, Leukotriene-

C4-regulated Ca2+ channels) (González-Cobos et al., 2013). Ainsi, de tels assemblages hétéromultimériques peuvent servir à augmenter la diversité fonctionnelle des canaux de la famille

Orai. Néanmoins davantage d'études sont requises afin de comprendre entièrement leurs fonctions physiologiques.

3. Interaction entre STIM1 et Orai1