Les voies de signalisation associées à Bcr-Abl

La transformation cellulaire par Bcr-Abl est due à la fusion des protéines Bcr et c-Abl qui entraîne l'adoption d'une conformation déterminant une activation constitutive de la kinase c-Abl (Pendergast et al., 1991, 1993) à la base du processus de leucémogenèse. En effet, ladérégulation de cette activité kinase est associée aux interactions de la protéine chimérique Bcr-Abl avec de nombreuses molécules jouant un rôle clé dans la régulationdes mécanismes cellulaires. Ces derniers sont à l o igi e d u e t a sfo atio de la ellule a e u ai tie de la p olif atio ellulaire, une résistance à l'apoptose et une altération de la fonction du cytosquelette avec une diminution de l'adhérence et une augmentation de la mobilité (Figure I.9). De plus, l o op ot i e B -Abl, contrairement à la protéine c-Abl qui peut être expri e da s le o au ou ie le toplas e, est retrouvée que dans le cytoplasme (McWhirter and Wang, 1993). Ai si, l e p essio pe a e te de cette protéine chimérique dans le cytoplasme favorise les interactions avec les différents substrats impliqués dans des voies de signalisation induisant la transformation de la cellule saine en cellule cancéreuse. En effet, la protéine Bcr-Abl est capable de s'autophosphoryler sur un résidu tyrosine 177 (Y177) (Zhao et al., 2002) et de phosphoryler de nombreux substrats, parmi lesquels se trouvent

des adaptateurs, conduisant ainsi à l'activation constitutive d'un réseau complexe de voies de signalisation. L'oncoprotéine Bcr-Abl constitue ainsi une plateforme de signalisation permettant l'activation de nombreuses voies de signalisation et la dérégulation de nombreux processus cellulaires (Sattler and Griffin, 2003).

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Figure I.9. Le réseau des voies de signalisation (non exhaustif) de Bcr-Abl. La dimérisation de Bcr- Abl déclenche la transactivation de Bcr-Abl par autophosphorylation activant la kinase et générant des sites de liaison pour des protéines adaptatrices permettant l'activation de plusieurs voies de signalisation. Ces voies de signalisation permettant une prolifération accrue, le maintien de la survie, l'inhibition de l'apoptose, ou encore la perturbation de l'adhérence cellulaire et de la mobilité sont responsables du processus de leucémogenèse.

a. La voie MAPK/ERK (Ras/Raf/MEK/ERK)

La voie Ras/Raf/MEK (Mitogen-activated ERK)/ERK (Extracellular signal-Regulated Kinases) permet la transduction de signaux depuis les récepteurs de surface jusqu'aux facteurs de transcription nucléaires entraînant alors la transcription de gènes impliqués notamment dans la

prolifération. Dans les cellules exprimant Bcr-Abl, l'activation constitutive de cette voie résulte en une prolifération incontrôlée (Jin et al., 2006; Mizuchi et al., 2005; Steelman et al., 2004). Bcr-Abl permet la transduction de signaux prolifératifs via l'activation de Ras, elle-même entrainée par le recrutement et la liaison du complexe Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2)/Gab2 (Grb2- associated-binding protein 2)/Sos (Son of sevenless) dépendant de la phosphorylation de la tyrosine

177 de Bcr (Chu et al., 2007; Mandanas et al., 1993) (Figure I.9). Ceci permet le recrutement à la e a e et l a ti atio de la “ i e/Th o i e ki ase ‘af. ‘af a alo s a ti e MEK / puis E‘K o duisa t à l a ti atio de fa teu s de t a s iptio i dispe sa les pou la p olif atio ellulai e (Goga et al., 1995; Raitano et al., 1995; Steelman et al., 2004). L'interaction Grb2/Y177 et la signalisation Ras sont essentielles pour l'activité transformante de Bcr-Abl. D'ailleurs, la mutation de

CDC42 RAC1 MOBILITE VAV BAD BCL-XL SURVIE RHOA ROCK1 ADF CLM MOBILITE AMOEBOÏDE ADHERENCE Protéines du cytosquelette SURVIE CRKL CBL CRK JAK2 PROLIFERATION STAT5 GRB2 GAB2 MYC RAS RAF MEK1/2 MAPK PROLIFERATION Dégradation p27 SKP2 PROLIFERATION PI3k AKT mTOR p70S6 4EBP1 Synthèse protéique ANCRAGE DANS ACTINE FILAMENTEUSE TRANSCRIPTION BCC Kinase DH PH C2

NH2 CAP SH3 SH2 L Kinase NLS NES COOH

BCC Kinase DH PH C2CAP SH3 SH2 L Kinase _NES

N LS Oligomérisation P210bcr-abl P P Transactivation Y177 Y1294 P P P P P P P P _P P P P P P P P P BCL-XL IΚΚB NFΚB CYCLE CELLULAIRE / Survivine ERKP OPN MICROENVIRONNEMENT DES CELLULES SOUCHES

LEUCEMIQUES

DIFFERENCIATION

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la tyrosine 177 (Y177F) inhibe la prolifération in vitro des p og iteu s h atopoï ti ues u i s et humains, transformés par Bcr-Abl (Chu et al., 2007; He et al., 2002; Zhang et al., 2001) ai si ue la leu og se da s u modèle murin, sans modification de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl (He et al., 2002). Enfin, la perturbation de la signalisation de Ras atténue le développement de la LMC induite par Bcr-Abl chez la souris. Ceci indique que Ras est une cible critique de Bcr-Abl dans la

pathogénèse de la LMC (Baum and Ren, 2008).

A noter que le microenvironnement leucémique joue un rôle important dans l'activation et le

maintien de la prolifération et la survie des cellules leucémiques (Basak et al., 2010). En plus de l'activité kinase de Bcr-Abl, la survie des cellules souches leucémiques dépend du soutien continu de la niche hématopoïétique (Warsch et al., 2013). Or, l'ostéopontine (OPN), un composant de la niche des cellules souches, a été rapporté comme étant surexprimé dans les cellules exprimant Bcr-Abl. Bcr-Abl entraîne en effet la surexpression de l'OPN en activant une cascade de signalisation

impliquant Ras, Raf et MAPK, indiquant que Bcr-Abl maintient un microenvironnement pour les cellules souches leucémiques à travers la voie Ras/Raf/MEK/ERK (Hickey et al., 2005).

b. La voie PI3K/Akt

La voie PI3K (PhosphatIdylinositol 3-Kinase)/Akt (Protein Kinase B) est une autre cascade de signalisation importante dans la LMC, activée par le recrutement du complexe Grb2/Gab2/Sos par la phosphotyrosine 177 (Calabretta and Skorski, 1996; Skorski et al., 1995). L'activation de la PI3K par Bcr-Abl repose également sur la phosphorylation de deux protéines adaptatrices CrkL (Crk-like protein) et Cbl (Casitas B-lineage Lymphoma) (ten Hoeve et al., 1994; Sattler et al., 1996) (Figure I.9).

La voie PI3K/Akt est apa le d a ti e les ellules sou hes h atopoï ti ues et ai si de les fai e passe d u tat uiescent à un état de prolifération dans la LMC (Li et al., 2015). La PI3K permet l'activation de la Serine/Thréonine kinase Akt qui active différentes voies de signalisation sulta t au ai tie de la su ie et à l aug e tatio de la p olif atio cellulaire, en favorisant la synthèse prot i ue ou la d g adatio d i hi iteu s du le ellulai e.

Akt contribue à activer mTOR (mammalian/mechanistic Target Of Rapamycin) de manière

directe en le phosphorylant. Une fois activé, mTOR phosphoryle deux cibles majeures que sont les S6 kinases et les 4EBP1 (eIF4E-binding proteins) (Hay and Sonenberg, 2004) permettant la stimulation de la synthèse protéique (Lynch et al., 2004; Pende et al., 2004). Elle peut aussi activer le cycle cellulaire via l'augmentation de l'expression de la protéine SKP2 (S-phase kinase-associated protein

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2), aboutissant à la dégradation de la protéine inhibitrice p27 et in fine à l aug e tatio de la prolifération (Agarwal et al., 2008; Andreu et al., 2005; Chu et al., 2010).

Akt possède de multiples substrats impliqués également da s la sista e à l apoptose. Pa exemple, la phosphorylation de la protéine pro-apoptotique Bad (Bcl-2-associated death promoter) entraîne sa séquestration dans le cytoplasme par la chaperonne 14-3-3, laissant libre Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) d i hi e l apoptose d le h e pa Ba (Bcl-2 associated X). La libération de Bcl-XL (B-

cell lymphoma-extra large) au niveau de la mitochondrie permet alors une inhibition du mécanisme apoptotique (Keeshan et al., 2002). De plus, Akt i hi e l a ti atio de g es p o-apoptotiques (Bim (BCL2L11, Bcl-2-like protein 11) et Trail (Tumor-necrosis-factor related apoptosis inducing ligand) en phosphorylant le facteur de transcription FOXO (Forkhead box protein O) ce qui empêche sa translocation dans le noyau (Hui et al., 2008; Naka et al., 2010). Cette kinase inhibe également la Sérine/Thréonine kinase G“k β Gl og e “ thase ki ase β et TO‘ (Cross et al., 1995; Osaki et al., 2004). Par ailleurs, Akt inhibe le suppresseur de tumeur p53 via l'augmentation de l'expression de MDM2 (E3-ubiquitine ligase) (Goetz et al., 2001). Enfin, la voie PI3K/Akt peut également activer la oie NF B (Nuclear Factor-kappa B), impliquée dans différentes voies de signalisation dont le ai tie de la su ie pa l a ti atio de g es i les (Ozes et al., 1999). En effet, l a ti it de NF B est nécessaire à la transformation des cellules primaires par l'oncogène bcr-abl (Reuther et al., 1998).

Il faut ajouter que l'expression de Bcr-Abl entraine également la production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS, Reactive Oxygen Species) par la signalisation (Y177/PI3K/mTOR) (Kim et

al., 2005) et inhibe les processus de réparation de l'ADN favorisant l'instabilité génétique (Sallmyr et al., 2008), et l'évolution de la maladie de la phase chronique vers la crise blastique en l'absence de traitement efficace.

c. La voie JAK/STAT

La famille des kinases JAK (Janus Kinase) est activée par des récepteurs aux cytokines et pe et à so tou l a ti atio des transducteurs de signaux et activateurs de transcription STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription). La voie JAK/STAT est constitutivement activée dans la LMC (Frank and Varticovski, 1996; Ilaria and Van Etten, 1996) (Figure I.9).

Bcr-Abl active directement JAK2 par phosphorylation entraînant l'augmentation de

l'expression de l'oncogène c-MYC et protègeant c-Myc de la dégradation (Xie et al., 2002). La surexpression de c-Myc joue un rôle critique dans la transformation leucémogène (Sawyers, 1993).

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Elle permet en outre l'activation du promoteur de la survivine, une protéine inhibitrice de l'apoptose (Fang et al., 2009). L effet de JAK a ti est i d pe da t de “TAT su l i du tio de l e p essio de c-M ais sti ule l a ti it de “TAT (Coppo et al., 2006; Xie et al., 2002). Ces résultats indiquent que JAK2 contrôle la stabilité et la signalisation oncogénique de Bcr-Abl (Hoelbl et al., 2010). De plus, JAK2 est également capable de phosphoryler directement Bcr-Abl au niveau de la tyrosine Y177 et ai si d augmenter sa demi-vie, améliorant la signalisation Bcr-Abl (He et al., 2002; Samanta et al., 2011).

Bcr-Abl entraîne également l'activation de JAK2/STAT5 par phosphorylation directe de STAT5 (Hantschel et al., 2012) mais aussi par l'intermédiaire de certaines kinases Src (Hck (Hematopoietic cell kinase), Lyn (Lck/Yes novel tyrosine kinase)) (Klejman et al., 2002; Samanta et al., 2011). Ceci permet alors l'expression de facteurs anti-apoptotiques comme Bcl-XL (Gesbert and Griffin, 2000;

Horita et al., 2000) favorisant la survie des cellules cancéreuses. A noter que cette voie est indispensable au développement de la LMC puisque l'absence de STAT5 inhibe la leucémogenèse myéloïde et lymphoïde (Hoelbl et al., 2010). E fi , “TAT i duit aussi a e “TAT l e p essio de - Myc et les gènes régulant le cycle cellulaire (cycline D1/D2) permettant de promouvoir la survie et la prolifération cellulaire (Horita et al., 2000; Steelman et al., 2004). Des études ont montré que l a ti atio de la oie JAK /“TAT est due à la p odu tio auto i e et pa a i e de GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) ou d IL (InterLeukin-3) (Jiang et al., 1999; Sirard et al., 1994). D ailleu s, la t a sfo mation oncogénique de Bcr-Abl nécessite la transactivation du epteu à l IL eli e à la oie JAK /“TAT (Tao et al., 2008).

d. La voie des GTPases de la famille Rho

L'isoforme p210bcr-abl possède une activité de facteur d'échange GDP/GTP (GEF) dans le domaine DH/PH permettant l'activation des GTPases de la famille Rho (Daubon et al., 2008; Harnois et al., 2003). Ce facteur d'échange active directement la GTPase RhoA (Ras homolog gene family member A) alors que Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) et Cdc42 (Cell division

control protein 42 homolog), également activés, le sont par l'intermédiaire d'un autre GEF (Vav) lié en complexe et régulé par Bcr-Abl qui permet sa phosphorylation (Bassermann et al., 2002) (Figure I.9). Ces Rho GTPases ont été rapportées comme étant suractivées dans les cellules Ph+ (Bassermann et al., 2002; Daubon et al., 2008; Harnois et al., 2003; Sahay et al., 2008; Skorski et al., 1998; Thomas et al., 2007) et sont impliquées dans la régulation du cytosquelette d'actine en jouant sur l'organisation et la dynamique des fibres d'actine, et ainsi sont essentielles dans les phénomènes de motilité cellulaire, d'adhérence et d'invasion à travers la matrice extracellulaire. Ces phénomènes

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so t essai es au ellules sou hes leu i ues afi u elles puisse t so ti de la i he hématopoïétique pour rejoindre le sang périphérique et ainsi développer la LMC. De plus, l'activation des GTPases de la famille Rho par Bcr-Abl joue très probablement u ôle i po ta t da s le p o essus de leu og se in vivo et notamment sur la survie et la prolifération, comme cela a été rapporté dans différentes études (Sengupta et al., 2010; Skorski et al., 1998; Thomas et al., 2007).

Ces protéines pourraient également être impliquées dans la régulation des propriétés de la cellule souche leucémique telles ue l auto e ou elle e t, la p olif atio ou e o e la diff e iatio (Xu et al., 2009). Enfin, l'activité de Rac1 et de Cdc42 semble dépendante de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl, alors que l'activation de RhoA reste présente lors de traitement par les inhibiteurs de tyrosine kinases (résultats non publiés). Ai si, il se le ue l a ti atio des ‘ho GTPases puisse joue u ôle da s la leu og se i d pe da e t de l a ti it t osi e ki ase de B -Abl.

e. Les protéines du cytosquelette

Les cellules exprimant Bcr-Abl présentent une diminution de l'adhérence aux cellules stromales de la moelle osseuse et à la matrice extracellulaire (Gordon et al., 1987; Verfaillie et al.,

1997). Or, l'adhérence au stroma permettant la régulation négative de la prolifération cellulaire, les cellules exprimant Bcr-Abl échappent ainsi en partie à cette régulation en vertu de leurs propriétés d'adhérence alt es. L I te f o -α, u age t th apeuti ue utilis da s la LMC restaure une adhérence normale (Bhatia et al., 1994). Des études ont montré l'implication des intégrines-, et plus pa ti uli e e t de l i t g i e-β , dans l'alt atio de l interaction entre le stro a et les p og iteu s ellulai es (Bhatia and Verfaillie, 1998). E effet, l e p essio de B -Abl induit des i te a tio s a o ales e t e l i t g i e-β et l a ti e du tos uelette sulta t e u e fo tio des i t g i es alt e espo sa le de l alt atio de l adh sio ellulai e et de l aug e tatio de la motilité des cellules LMC (Bhatia et al., 1999; Salesse and Verfaillie, 2002). En outre, il a été rapporté

que CrkL, est impliquée dans la régulation de la motilité cellulaire (Uemura et al., 1999) ainsi que dans l'adhérence cellulaire médiée par les intégrines (Sattler et al., 1996) en association avec d'autres protéines des adhérences focales comme la paxilline, FAK (Focal Adhesion Kinase), p130Cas (p130 Crk-associated substrate) (Salgia et al., 1996) ou encore Hef1 (Human enhancer of filamentation protein 1) (Sattler et al., 1997). Enfin, il est probable que les modifications de l'adhérence et de la

motilité des cellules Ph+ soient liées à l'activation des voies de signalisation faisant intervenir les molécules d'adhérence citées précédemment et Rac1 (Gotoh et al., 1995). Il est ainsi possible que l'activation inappropriée de ces molécules puisse être responsable du déficit des intégrines dans les

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f. L’i pli atio de la PKC

La superfamille des PKCs (Protein Kinases Calcium dependent) est réprésentée par un groupe

de onze isoformes qui sont des Sérine/Thréonine kinases (Nishizuka, 2003). Initialement, les PKCs ont été décrites comme étant exclusivement dépendantes du calcium et du diacylglycérol (DAG) (Nishizuka, 1984), mais elles peuvent aussi être régulées par des messagers secondaires lipidiques tels que les phosphatidylsérines (PS) et les sphingolipides. Les PKCs sont divisées en trois classes comprenant différentes isoformes avec des fonctionnalités particulières : les PKCs « classiques » ou

« conventionnelles » (PKCα, PKCβI, PKCβII, PKC ) qui sont dépendantes du calcium et activées par le DAG et les PS, les « nouvelles » PKCs (PKC , PKC , PKC , PKC , PKCθ) qui sont seulement régulées par le DAG et les PS, et les PKCs « atypiques » (PKC , PKCί/ ), qui sont indépendantes du calcium et du DAG. Ces différentes isoformes sont groupées selon leurs similarités structurales et/ou en

fonction des sig au d a ti atio diff e ts (Redig and Platanias, 2007). De plus, elles sont réponsables de la odifi atio des a ti it s d u la ge a tail de protéines, incluant des récépteurs, des enzymes métaboliques, des protéines du cytosquelette ou encore des facteurs de transcription (Breitkreutz et al., 2007). E fi , l a ti atio des PKCs s a o pag e t de leur phosphorylation jouant un rôle crucial dans la régulation de toutes les PKCs (Newton, 1996).

Les PKCs sont impliquées dans plusieurs processus cellulaires tels que la prolifération, la différentation, la polarité, la survie, et elles jouent ainsi un rôle important dans de nombreuses voies de signalisations oncogéniques impliquant notamment celles dépendantes de Bcr-Abl (Hickey et al., 2005) (Figure I.10). En effet, l e p essio et l a ti it de la PKC, so t aug e t es da s les ellules de patients atteints de LMC (Kundu et al., 1991). Alo s ue la PKC est fortement exprimée dans la LMC, les PKCα,β, ί, θ et sont présentes à des niveaux faibles dans le cytoplasme des cellules LMC, et leur activité kinase respective est également significativement diminuée (Balasubramanian et al., 2002). PKCί est l u e des i les de B -A l i pli u da s la sista e à l apoptose in vitro après traitement par des agents anti- a eu . De plus, la PKCί a ti e pe et le ai tie de la su ie ellulai e ia l a ti atio de la oie NF B (Lu et al., 2001) ; et l i du tio de la PKCί est d pe da te de l a ti it MEK1/2 (Gustafson et al., 2004). Enfin, la PKCί pa ti ipe gale e t à la diff e tiatio ellulai e e entraînant la diminution de la transcription des ARNm de Bcr-Abl via la voie MAPK (Lindner et al., 2003). Co e a t la PKC , il a t o t ue le t aite e t à l I te f o -α entraîne la phospho latio de ette isofo e et l a ti atio du do ai e ki ase, da s des lig es ellulai es LMC. Fi ale e t, la PKC est i po ta te pou la phosphorylation de STAT1, un membre de la voie JAK/STAT (Kaur et al., 2005). L a ti atio de “TAT gule gati e e t la p olif atio ellulai e, à l oppos de “TAT ou “TAT , ui so t o stituti e e t a ti s pa B -Abl (Benekli et al., 2003). E fi , PKCα et PKCβ so t gale e t des i les de B -Abl impliquées dans la résistance aux

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t aite e ts. E effet, l e p essio de es isofo es est li e à la su e p essio du epteu t osi e kinase AXL, entraînant l a ti atio o stituti e de la oie E‘K / (Dufies et al., 2011).

Figure I.10. Implication des PKC dans les voies de signalisation dépendantes de Bcr-Abl. Bcr-Abl régule différentes isoformes de la PKC jouant dans différentes voies impliquées dans la leucémogenèse. Adaptée de (Mencalha et al., 2014).