Structure et domaines de RAD

RAD51 est une protéine de 339 acides aminés pour un poids moléculaire de 37 kDa. La séquence de RAD51 est très bien conservée dans l’évolution, en effet, RAD51 partage 98,8% de similarité avec son homologue chez la souris mmRad51 (Mus musculus Rad51) et 81% de similarités avec son homologue chez la bactérie Saccharomyces

cerevisiae ScRad51 (Saccharomyces cerevisiae Rad51) 126,127_.

Actuellement, aucune structure complète de RAD51 n’a été élucidée. Les structures cristallines de ScRad51 tronquée au niveau de l’acide aminé située en position 79 128_{, une structure chez RadA de Pyrococcus furiosus} 129 _{et cinq structures de RadA}

chez Methanococcus voltae 130,131 _{et Sulfolobus solfataricus} 132 _{sont accessibles}

actuellement.

RAD51, comme RadA est constitué de deux grands domaines N-ter et un domaine central en C-ter (Core domain). Ces deux structures ont été résolues par RMN pour le domaine N-ter 133 _{et par cristallographie pour le domaine central} 134 _{(Figure 9).}

La conservation des domaines chez les protéines de la famille RecA est forte. Le core domain, partie centrale des protéines de la famille RecA est représenté en gris. Dans ce core domain, on retrouve les domaines Walker A et B, nécessaires à la liaison à l’ATP et son hydrolyse (séquences en noir). Il existe une partie N-ter conservée chez Rad51, RadA et RadA2 (section hachurée). Les parties qui ne présentent aucune identité sont représentées en gris pâle. (Adapté de 426₎

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2.1.2.1. Domaine de liaison à l’ADN db

La partie N-ter de RAD51 comporte un motif HhH (Helix-hairpin-Helix, pour Hélice-boucle-Hélice) (résidus 61 à 69) nécessaire à la liaison à l’ADNdb 133_{. Ce motif}

est très conservé dans l’évolution et présent dans de nombreux types de protéines aptes à lier l’ADNdb, comme des ADN polymérases, ADN ligases dépendantes du NAD+ ou encore des ADN glycosylases 135,136_.

Le rôle de l’ion Ca2+ _{est également important dans la liaison de RAD51 à}

l’ADNdb, puisqu’il participe notamment à l’augmentation de la rigidité du nucléofilament une fois RAD51 associé à l’ADNdb et permet ainsi une meilleure stabilité de cette structure 137_.

A forte concentration en RAD51, le filament de RAD51-ADNdb aurait tendance à former des structures filamentaires discontinues entrecoupées par de l’ADN nu. Ce type de structure n’est pas retrouvé chez l’homologue de RAD51, RecA 138_.

2.1.2.2. Domaine de liaison à l’ADNsb

Le domaine de liaison à l’ADNsb de RAD51 est constitué de deux structures appelées boucles L1 et L2 situées dans la partie C-ter de la protéine. Ces boucles ont été découvertes et décrites chez RAD51 ainsi que chez ses homologues que sont MvRadA, ScRad51 et EcRecA 128–130,134,139_.

Les structures de RAD51 et ses homologues ont été plus ou moins résolues. Story et collaborateurs ont mis en évidence la présence de deux boucles L1 et L2 chez RecA

139_{. Cette structure serait ainsi capable de lier l’ADP et l’ADN chez RecA, et par extension}

chez RAD51, via des études comparatives de structures protéiques. Matsuo et collaborateurs ont ensuite montré que ces boucles flexibles étaient importantes pour lier l’ADN chez RAD51, en étudiant le comportement de mutants RAD51 pour des acides aminés situés au niveau des boucles L1 et L2 140_{. Dans cette étude, les mutations sur les}

résidus Asp231, Tyr232, Ser233 et Gly236 de RAD51 sont les plus délétères dans la fonction de liaison à l’ADN. Des mutations sur des résidus de la boucle L2 montrent que ce site semble moins important dans la liaison à l’ADNsb. Le modèle proposé suggère que le résidu Tyr232, situé dans la boucle L1, qui sert d’ancrage en permettant, via son intercalation dans la double hélice d’ADN, l’alignement des monomères de RAD51 le long de l’ADN pendant l’assemblage du filament. Le résidu Arg235, aussi situé dans la

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boucle L1, interagirait ainsi avec le squelette phosphate de l’autre brin d’ADN via des interactions électrostatiques 141,142_.

Récemment, il a été montré que RAD51 ne pouvait former un filament autour de l’ADNsb sans se lier à l’ATP 143_{. RAD51 forme un filament par auto-association entre}

les monomères en absence de Ca2+_{, d’ATP et d’ADN. En présence d’ADNsb, RAD51}

forme un filament non-structuré et lorsque du Ca2+ _{et de l’ATP sont présents, le filament}

de RAD51 se réorganise pour former des structures en anneau et en courtes hélices, soulevant ainsi le fait que l’ATP puisse jouer un rôle structurel dans la formation du nucléofilament lors de la phase présynaptique 143_.

Via ses deux domaines de liaison à l’ADNsb, RAD51 est capable de s’associer à l’ADN et initier la formation du nucléofilament de RAD51 autour de l’ADN.

2.1.2.3. Domaine de polymérisation (PM)

RAD51 possède entre ses deux principaux domaines un motif de polymérisation nécessaire à la formation du nucléofilament de RAD51 lors de la phase pré-synaptique de la RH.

La polymérisation de RAD51 a été étudiée chez l’archée Pyrococcus furiosus par crystallographie 129_{. La structure de la protéine a été élucidée dans cette étude et le rôle}

de BRCA2 et plus particulièrement des motifs répétées BRC, capables de lier le motif de polymérisation de RAD51.

Subramanyam et al 144 _{ont récemment confirmé l’importance du domaine N-ter de}

RAD51, capables d’interagir avec BRCA2. Ils ont ainsi pu générer une forme cristallisée de la partie N-ter de RAD51 fusionnée au peptide BRC4. Ce peptide se fixe à RAD51 en mimant les motifs répétés de BRCA2. Ces motifs, au nombre de 8 séquences d’environ 35 acides aminés, sont situés sur la partie centrale de la protéine et permettent notamment l’interaction entre BRCA2 et RAD51, les motifs répétées BRC3 et BRC4 jouant un rôle important dans cette interaction 145_{. Le résidu S3291 dans la partie C-ter de BRCA2 joue}

également un rôle important dans cette interaction. En effet, lorsque ce résidu est phosphorylé, RAD51 se dissocie de BRCA2 146–150_{. Cette interaction est à la base du}

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2.1.2.4. Domaine de liaison à l’ATP

Pour assurer un rôle actif, RAD51 est capable de lier et hydrolyser l’ATP. Dans ce but, la protéine possède un domaine Walker A et un domaine Walker B au centre de la protéine.

Il a été montré que la liaison de l’ATP à la protéine, et pas nécessairement son hydrolyse, est suffisante pour permettre à RAD51 d’exercer son activité de recombinase

151,152_.

Amunugama et al 153 _{ont montré que les résidus F129 et H294, situés}

respectivement dans les domaines Walker A et dans la boucle L2, sont importants pour l’activité recombinase de RAD51. La substitution de ces résidus par des résidus valine entraine une diminution de l’activité ATPase de la protéine aboutissant à un défaut de formation du nucléofilament protéique.

Figure 10 - Domaines de la protéine RAD51 humaine.