2.1. RAD51 ou la protéine centrale de la recombinaison homologue
2.1.3. Les rôles de RAD51 durant la recombinaison homologue
Nous verrons ici les différentes activités de RAD51 au cours du processus de réparation des CDB par RH. Ces différentes activités seront plus approfondies par la suite.
Avant d’intervenir dans la RH, l’ADN au niveau de la cassure est résecté, générant ainsi des extrémités 3’-sortantes. C’est le point de départ de la phase pré-synaptique de la
La protéine RAD51 humaine possède quatre grands domaines. Situé en N-ter de la protéine, le motif HhH (Helix-hairpin-Helix, pour Hélice-boucle-Hélice) permet l’association à l’ADNdb. Le motif de polymérisation (PM) constitue la région d’interaction entre deux monomères de RAD51, jouant un rôle prépondérant dans la formation du filament de RAD51. Les domaines Walker A et B constituent la partie centrale de la protéine et permettent la fixation et l’hydrolyse de l’ATP. Enfin, le dernier domaine de RAD51 est composé de deux boucles L1 et L2, permettant l’association de la protéine à l’ADNsb 131,134,140,141.
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RH, durant laquelle RAD51 est recruté au niveau de la zone lésée et forme un nucléofilament avec l’ADNsb. Cette étape nécessite la fixation de l’ATP par RAD51.
Durant l’étape suivante, la phase synaptique, le nucléofilament recherche une homologie de séquence. Une fois l’homologie trouvée, RAD51 catalyse l’échange de brins entre l’ADNsb issu de la cassure et l’ADNdb de la matrice intacte. La structure formée est appelée D-loop (displacement loop).
Durant la phase post-synaptique, la troisième et dernière étape de la RH, RAD51 participe à la formation des jonctions de Holliday, extension de la structure en D-loop de l’étape précédente. Ces structures sont ensuite résolues par des résolvases et des hélicases. RAD51 n’a pas un grand rôle durant cette phase, cette étape signifiant surtout le départ de RAD51 de l’ADN. Celle-ci est active et nécessite l’hydrolyse de l’ATP.
Au fil des étapes de la RH, RAD51 sollicite ainsi différentes interactions avec l’ADNsb, l’ADNdb, l’ATP mais également avec d’autres monomères de RAD51. Toutes ces interactions définissent les différentes activités de RAD51, comme la liaison à l’ADNsb ou l’ADNdb, son activité recombinase, l’hydrolyse de l’ATP ou encore la capacité à former un nucléofilament. Ces activités sont décrites dans la suite du manuscrit.
2.1.3.1. L’interaction RAD51-RAD51
Via son motif de polymérisation (PM), RAD51 est capable de s’associer à un second monomère de RAD51 148,154. Ceci s’accompagne de la liaison de RAD51 à
l’ADNsb ou l’ADNdb 142 et entraine différents degrés de polymérisation de RAD51 148,154. En absence d’ADN, RAD51 forme un anneau heptamérique ou octamérique selon
les organismes 129,155.
Comme dit précédemment, ce sont les résidus situés entre les positions 86 et 97 qui sont responsables de la polymérisation. D’autres résidus sont suggérés pour intervenir dans l’interaction monomère-monomère, il s’agit des résidus Tyr188, chez un homologue de RecA nommé Rad51.1 de Xenopus, (correspondant à Tyr191 chez hRAD51) et Tyr315, chez RAD51 humaine 156,157.
La capacité de RAD51 à s’auto-associer est primordiale puisqu’elle est à la base de toutes les activités de RAD51 au cours de la RH. Lorsque l’on empêche RAD51 de s’auto-associer, cela perturbe totalement les fonctions de RAD51, notamment son activité recombinase. L’utilisation de petits peptides imitant le motif BRC4 de BRCA2 ou encore
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des mutations sur RAD51 au niveau du domaine de polymérisation entraine une perte de l’activité recombinase de RAD51 145,149,158.
2.1.3.2. La formation du nucléofilament
La première phase de formation du nucléofilament est la nucléation. Celle-ci correspond à la fixation de 4 à 5 monomères de RAD51 sur l’ADNsb issu de la résection
159,160. L’association et la dissociation des monomères de RAD51 sont très dynamiques,
les monomères se liant à l’ADN et le quittant rapidement 90,154. Une fois les monomères
fixés à l’ADNsb, ceux-ci servent de point d’ancrage à d’autres monomères de RAD51 pour réaliser l’extension du nucléofilament. Ces points de nucléation, si le nucléofilament ne s’allonge pas, peuvent se dissocier de l’ADNsb. C’est en effet la longueur du nucléofilament qui détermine sa stabilité 154. La nucléation est observée tous les 500pb
au minimum, le nucléofilament recouvre presque la totalité de l’ADNsb présent à la cassure, mis à part quelques portions pour lesquelles la nucléation n’est pas réalisable, par manque d’espace 90.
L’hélice que forme le nucléofilament est de forme dextrogyre, un tour d’hélice étant formé de 18,6 bases et de 6 monomères de RAD51 161. L’ATP revêt une grande
importance dans la formation du nucléofilament. En présence d’ATP, le filament aura une conformation plus compacte alors qu’en absence d’ATP, celle-ci sera plus relâché. Ce processus est réversible, un filament privé d’ATP peut de nouveau s’allonger s’il est en présence d’ATP 143,162. L’importance de l’ATP est également soutenue par une étude
sur des mutants de RAD51, sur le résidu Lys133 152.
Plusieurs partenaires interagissent avec RAD51 pour faciliter son recrutement au niveau de la cassure, il s’agit de BRCA1, BRCA2 et PALB2. Le processus de recrutement de RAD51 au niveau de la CDB est connu et met en jeu le recrutement de BRCA1, qui joue un rôle également dans la fin de la résection 163–167, qui s’associe à PALB2 pour
former ensuite un complexe avec BRCA2. C’est BRCA2 et PALB2 qui agissent ensuite directement avec RAD51 pour l’amener à la cassure 70–72,168,169. Récemment, il a été
montré que la protéine DSS1 participerait également à l’arrivée de RAD51 à la cassure. DSS1 mimerait l’ADNsb pour diminuer l’affinité de RPA pour l’ADNsb, et faciliter son départ 89.
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RAD52 participe également à l’interaction de RAD51 avec l’ADN. RAD52 forme des complexes structuraux avec RAD51 et l’ADNdb 170 et permet le recrutement de
RAD51 sur l’ADNsb recouvert de RPA 78.
Comme expliqué dans la partie 2.1.2, les domaines Walker A et Walker B, pour la liaison à l’ATP, et les boucles L1 et L2, pour l’association à l’ADNsb, de RAD51 sont sollicités pendant l’étape de formation du nucléofilament 140,142,143,152.
Lorsque l’on se penche sur les homologues de RAD51, on peut noter que la formation du nucléofilament est l’étape la plus étudiée et qu’il existe des différences dans la manière dont les boucles interagissent avec l’ADN 142. Ceci est sûrement dû à la
différence de séquences des boucles entre les espèces et donc à une différence d’interaction entre l’ADN et la protéine 140. Le processus de nucléation a également été
étudié pour ScRecA. Il s’avère qu’il est nécessaire qu’un dimère de ScRecA s’associe à l’ADNsb et que ce phénomène est dépendant de la composition en nucléotides et de la concentration en cofacteurs ioniques comme le Ca2+, le Na+ et le Mg2+171,172. L’extension
se déroule dans les deux sens, cependant, l’élongation dans le sens 5’-3’ est plus rapide. Des médiateurs comme ScRecO, ScRecR ou ScRecF participent à la modulation de la nucléation de ScRecA 173.
2.1.3.3. La recherche d’homologie et l’activité recombinase
Après que RAD51 se soit associée à l’ADNsb formant ainsi le nucléofilament, elle doit rechercher l’homologie avec la séquence d’ADNdb matrice et réaliser l’échange de brins. Au contraire de RecA, où le phénomène est bien décrit 174,175, l’association de
RAD51 à l’ADNdb et la recherche d’homologie est moins bien comprise 176. En se basant
sur les mécanismes décrits pour RecA, il est suggéré que l’ADNsb se fixe d’abord sur un site de RAD51, puis l’ADNdb se lie à un second site avec une affinité moindre. Ceci a pour but d’effectuer un roulement dans les séquences d’ADNdb associées à RAD51 afin de trouver l’homologie avec l’ADNsb issu de la cassure 177,178. Cette activité a été
observée chez la levure avec le phénomène de mobilité de la zone de cassure 179.
Dans cette optique de recherche d’homologie, la protéine RAD54 joue un rôle important vis-à-vis de RAD51180. Une étroite collaboration existe entre RAD51 et
RAD54 conditionnant la dynamique de RAD51 et son association avec l’ADNdb, notamment grâce aux activités ATPasiques des deux protéines 181.
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Lorsque RAD51 recherche une homologie de séquence, elle tolère une certaine hétérologie. Cette hétérologie a été chiffrée au nombre de 4 mésappariements acceptés
182. La tolérance est augmentée lorsque l’activité ATPasique de RAD51 est diminuée,
comme c’est le cas pour le mutant RAD51 K133R 182.
Tout récemment, une étude a proposé un modèle pour la recherche d’homologie par les recombinases de la famille RecA, dont RAD51 fait partie 183. Il est basé sur la
recherche de micro-homologie entre l’ADNsb et l’ADNdb, puis par une dissociation si l’homologie n’est pas correcte. Ce phénomène serait très rapide, pour une homologie d’au moins 8 nucléotides entre les deux séquences. L’homologie parfaite semble être d’au moins 8 nucléotides, aucune association n’étant observée pour 7 nucléotides. Dans ce modèle, si l’association avec une séquence de 8 nucléotides est parfaite, la recherche continuera sur le 9ème nucléotide, qui semble jouer un rôle important. RAD51 continuera
de chercher une homologie par triplet de nucléotides avec un seuil qui semble être de 15 nucléotides pour la séquence d’ADNdb homologues. Au-delà de ce seuil, la dissociation et l’échange avec une autre séquence à scanner est moindre (Figure 10). De manière intéressante, des résultats similaires ont été observés pour d’autres protéines de la famille RecA (ScDmc1 et ScRecA). Ce phénomène semble donc conservé à travers l’évolution, indiquant l’importance de ce processus dans la recherche d’homologie.
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Figure 11 - Modèle de recherche d'homologie par RAD51.