Les deux molécules diminuent la survie cellulaire des cellules EUFA

Afin de valider l’effet observé in vitro, nous avons voulu évaluer l’effet de ces molécules in cellulo. Pour cela, nous avons réalisé des tests de survie cellulaire avec des cellules EUFA-1341, exprimant une forme tronquée et inactive de PALB2. Chacune des deux molécules entraine une augmentation de la mortalité cellulaire. L’effet de létalité synthétique observé est le plus important en présence de SL52-2 (Figure 28-B), cependant, c’est aussi cette molécule qui induit une plus forte toxicité cellulaire à forte dose. L’effet de SL52-2 est observable pour une concentration de 100 nM. SL52-1 est également efficace mais à plus forte concentration (Figure 28-A), une différence de

Le criblage d’une banque de 696 molécules a permis de mettre en évidence deux molécules inhibitrices de RAD52 : SL52-1 (A) et SL52-2 (B). Les concentrations en SL52-1 sont de 200 M, 400 M, 600 M et 1 mM, selon le sens de la flèche. Concernant SL52-2, les concentrations utilisées sont de 25 M, 50 M, 100 M et 200 M, selon le sens de la flèche.

La figure représente les structures des deux molécules mises en évidence par le test d’hybridation. Il s’agit de SL52-1 (A) et SL52-2 (B).

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mortalité entre les cellules EUFA-1341-PALB2WT et EUFA-1341 étant observée pour une concentration de 100 M.

Figure 29 - Impact des molécules SL52-1 et SL52-2 sur la survie cellulaire de cellules déficientes en PALB2.

4. Discussion

L’intérêt pour RAD52 a pris de l’importance dans les avancées thérapeutiques récentes. Il a été montré qu’un phénomène de létalité synthétique existe lorsque l’on inhibe RAD52 dans des cellules déficientes en PALB2, BRCA1 284 _{ou BRCA2} 78_{. Les}

gènes PALB2, BRCA1 et BRCA2 sont parmi les gènes les plus mutés dans les cas de cancer du sein notamment. Via ces découvertes, l’intérêt de rechercher et d’optimiser des inhibiteurs de RAD52 a grandi. Actuellement, trois études ont mis en évidence des molécules capables d’inhiber RAD52 aussi bien in vitro qu’in cellulo 346,347,368_.

Trois méthodes ont été jusqu’ici développées pour mettre en évidence des inhibiteurs de RAD52. La première utilise le docking de molécules à cribler avec la forme undécamérique de RAD52 (PDB : 1KN0 ; 277₎ 347_{. Ce criblage a permis de définir un}

classement de molécules les plus affines pour cette forme de RAD52, en se basant notamment sur les interactions électrostatiques et hydrophobiques. Une seconde méthode basée sur la polarisation de fluorescence a été développée pour suivre l’association de RAD52 à l’ADNsb 346_{. En se liant à l’ADN, RAD52 entraine une augmentation détectable}

de la polarisation de fluorescence. La méthode développée dans notre étude se base sur

Des cellules EUFA1341 déficientes en PALB2 et le même type cellulaire complémenté sont incubés en présence de concentrations croissantes en SL52-1 (A) et SL52-2 (B) pendant 7 jours. La survie cellulaire est ensuite mesurée via un test MTT.

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une autre capacité de RAD52, à savoir sa fonction d’hybridation de deux ADNsb. Enfin, une troisième équipe a développé une technique de criblage en utilisant la capacité d’hybridation de RAD52 368_{. Cette technique est assez proche de celle utilisée dans notre}

étude puisqu’elle se base sur deux ADNsb, l’un marqué par un fluorophore et l’autre par un atténuateur de fluorescence. La différence réside dans la non-complémentarité totale entre les deux brins d’ADN. En effet, un mésappariement existe, ce qui a pour conséquence de limiter l’hybridation spontanée entre les deux brins. Dans notre étude, nous avons développé une méthode de criblage à haut débit assez proche de cette dernière étude.

Nous avons criblé une banque de 696 molécules à la recherche de candidats potentiels comme inhibiteurs de RAD52. Nous avons ainsi mis en évidence deux molécules capables d’inhiber RAD52. Grâce à un test d’hybridation in vitro développé à cette occasion, nous avons montré que SL52-1 et SL52-2 sont efficaces de manière concentration dépendante. Parmi ces deux molécules, c’est SL52-2 qui est la plus efficace. Pour obtenir une inhibition totale de l’hybridation par RAD52, il nécessite une concentration cinq fois moins forte que celle de SL52-1.

Nous avons également évalué l’effet de ces deux molécules sur la capacité de survie de cellules EUFA1341. Ces cellules sont caractérisées par l’apparition d’un codon stop prématuré dans la séquence codante du gène (1802T A, Y551X), aboutissant à l’expression d’une forme tronquée et inactive de la protéine PALB2 369_{. Les deux}

molécules ont un effet sur les cellules EUFA1341 mais la molécule la plus efficace demeure SL52-2 confirmant nos résultats in vitro. Il est à noter que ces deux molécules à forte dose sont toxiques pour les cellules complémentées en PALB2.

Les deux molécules mises en évidence possèdent des groupements similaires. Elles possèdent toutes les deux un noyau benzénique, ainsi qu’un groupement amide. De manière intéressante, les deux molécules exhibent un groupement halogéné (Br ou Cl), considéré comme un donneur d’électrons et donc facilement réactif.

Les résultats obtenus restent préliminaires et nécessitent une caractérisation plus approfondie. Il serait ainsi intéressant de confirmer l’impact des deux molécules sur l’hybridation par RAD52 par une technique de détection par radioactivité dont on dispose dans le laboratoire 370_{. Un test de liaison à RAD52, par exemple par résonance}

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entre chaque molécule et la protéine, pour en déterminer l’affinité. L’impact cellulaire est également à évaluer, notamment en continuant les tests de survie cellulaire, par des tests de clonogénie par exemple, mais également en étudiant leur impact sur la formation des foyers RAD52. L’impact des molécules sur l’efficacité de la SSA peut également être évalué par des tests cellulaires utilisant un rapporteur fluorescent, comme cela a été décrit

368_{. La synthèse de nouveaux dérivés de SL52-1 et SL52-2 est également envisagée, afin}

d’obtenir des molécules plus efficaces ciblant RAD52.

5. Conclusion

Nous avons réussi à développer une méthode de mesure et d’analyse de la capacité de RAD52 à hybrider deux ADNsb. Cette nouvelle méthode a été utilisée pour cribler une banque de 696 molécules afin de mettre en évidence deux molécules capables d’inhiber RAD52 de manière dose-dépendante. Ces deux molécules ont un effet cellulaire, puisqu’elles induisent également la mort de cellules déficientes en PALB2. Cependant, elles exhibent un caractère cytotoxique potentiellement néfaste. Cette première approche dans la recherche d’inhibiteurs de RAD52 apparait prometteuse mais demande un approfondissement dans les tests biochimiques et cellulaires. Ces molécules pourraient constituer le point de départ du développement d’une nouvelle classe d’inhibiteurs dont les dérivés pourraient amener à augmenter l’efficacité antitumorale tout en diminuant l’effet cytotoxique sur les cellules normales.

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Chapitre 6 - Discussion