Le DIDS et les dérivés N3 et NAc n’ont pas d’effet dans la cellule sur RAD

En ce qui concerne l’effet des molécules sur RAD52 in cellulo, nous avons traité des cellules PALB2 déficientes avec les molécules (Figure 24). En effet, un effet de létalité synthétique existe lorsque l’on inhibe RAD52 dans des cellules déficientes en

PALB2 284_{. Sur les trois molécules capables d’inhiber la fonction d’hybridation de RAD52} in vitro, aucune ne semble avoir d’effet sur la viabilité de ces cellules. On observe une

légère diminution de viabilité, mais aucune différence lorsque les cellules sont incubées en présence ou non des molécules. Ceci semble indiquer que les trois molécules actives

in vitro ne le sont plus dans la cellule, même à forte concentration (jusqu’à 100 M).

Figure 25 – Impact du DIDS et de ses dérivés sur la viabilité de cellules déficientes en PALB2.

4. Discussion

La recherche et le développement de nouvelles molécules anti-cancéreuses constituent un véritable challenge dans la recherche de solutions au traitement du cancer. Le rôle de RAD51 dans plusieurs types de cancer 209–212 _{nous a conduits à nous intéresser}

Les cellules EUFA1341-PALB2WT et EUFA1341 sont incubées pendant 5 jours en présence de différentes concentrations (10 nM, 100 nM, 1 mM et 10 mM) de trois molécules : (A) DIDS, (B) dérivé N3 et (C) le dérivé NAc. Pour mesurer l’impact des molécules, un test de survie par MTT est réalisé. La lecture des plaques a été faite sur un appareil Cytation 5.

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au DIDS, une petite molécule de la famille des stilbènes dont l’effet sur RAD51 a été démontré mais son mécanisme pas encore résolu 340_{. Pour ce faire, nous avons voulu}

évaluer l’impact de molécules dérivées du DIDS sur RAD51, en commençant par sa capacité de liaison à l’ADNsb. Pour cela, nous avons utilisé la détection de l’interaction ADNsb-RAD51 par bio-layer interferometry. Nous avons montré que le DIDS ainsi que les dérivés N3 et NAc, à la différence des dérivés NH2 et NO2, empêchent la liaison de RAD51 à l’ADNsb et dissocient le nucléofilament. Cet effet est dépendant de la concentration en molécule, le DIDS étant la molécule la plus active des trois. En plus de l’effet sur la liaison de RAD51 à l’ADNsb, ces trois molécules actives le sont également sur la fonction de formation de D-loop de RAD51. L’effet dose-dépendant de ces trois molécules est également retrouvé dans cette inhibition. En plus d’avoir un effet in vitro, ces trois molécules agissent in cellulo, en empêchant la formation de foyers RAD51 dans la cellule après induction de CDB. Il a déjà été montré que le DIDS entrainait une diminution du nombre de foyers RAD51 dans des cellules B après irradiation 342_{. Le DIDS}

et le dérivé N3 sont également capables d’induire une diminution de l’efficacité de la RH. Ces résultats demandent une confirmation. En effet, une variabilité dans l’efficacité de transfection peut totalement affecter le rendement de la RH 358_.

La linéarité chimique des groupements isothiocyanate du DIDS et du dérivé NAc, ainsi que celle des groupements azide présents sur le dérivé N3 pourrait jouer un rôle important dans leurs capacités à inhiber RAD51. En effet, le groupement azide est un groupement chimique connu pour être peu réactif biologiquement 359_{. En effet, le}

groupement azide est peu électrophile et de ce fait n’interagit pas avec les amines et d’autres nucléophiles forts que l’on retrouve en abondance dans les systèmes biologiques. Cependant, il existe une molécule thérapeutique possédant un groupement azide, et utilisé dans le traitement du SIDA. Il s’agit de l’AZT (azidothymidine ou 1-[(2R,4S,5S)-4-azido- 5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione[1]), un inhibiteur de la transcriptase inverse, qui est incorporé dans la séquence nucléotidique de l’ADN viral entrainant l’arrêt de la transcription 360_{. Malgré cela, le groupement azide est notamment}

utilisé dans les réactions de chimie click ou comme rapporteur chimique dans les systèmes vivants 359_{. L’effet du dérivé N3 reste intéressant dans notre cas. Etant donné la faible}

réactivité du groupement azide dans un système biologique et dans nos conditions expérimentales, la linéarité de ce groupement, similaire à celle du groupement

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isothiocyanate pourrait être liée à l’inhibition de RAD51. Cette caractéristique ouvre des perspectives intéressantes dans le développement d’inhibiteurs de RAD51.

RAD51 et RAD52 ne font pas partie de la même famille protéique, RAD51 appartenant à la famille des protéines RecA 124 _{alors que RAD52 est lié à la famille des}

protéines RAD52 361_{. Il existe ainsi peu de similarités entre les deux protéines} 362–364_{, ce}

qui n’expliquent pas l’effet observé à la fois du DIDS et des dérivés N3 et NAc sur RAD51 et RAD52 in vitro, et cela même à des concentrations faibles. En effet, des structures similaires entre les deux protéines auraient pu expliquer la liaison de ces molécules au niveau d’un site retrouvé sur les deux protéines. Cependant, les deux protéines possèdent des sites de liaison à l’ADNsb dont les caractéristiques structurales sont possiblement ressemblantes. A noter également que les trois molécules actives in

vitro, ne le sont plus in cellulo sur RAD52. En les testant dans des cellules déficientes en PALB2, pour lesquelles une létalité synthétique a été observée lorsque RAD52 était

inhibée 284_{, la viabilité cellulaire n’est pas affectée. L’effet in cellulo de ces trois mêmes}

molécules a été observé pour RAD51, puisqu’elles entrainent une diminution des foyers RAD51 dans des cellules HeLa après induction de CDB. Cette différence peut s’expliquer par un mode d’action différent de ces trois molécules vis-à-vis des deux protéines et une affinité beaucoup plus forte pour RAD51.

5. Conclusion

La recherche de médicaments ciblant le cancer constitue un challenge important de nos jours. Cibler la réparation de l’ADN et notamment RAD51 fait partie des stratégies étudiées actuellement et quelques molécules ont montré des résultats intéressants et prometteurs. Dans cette étude, nous avons montré que le DIDS peut inhiber RAD51 et RAD52 in vitro, mais a un effet in cellulo uniquement sur RAD51. Le rôle des groupements isothiocyanate du DIDS dans l’inhibition de RAD51 semble se confirmer par l’utilisation de molécules dérivées. Ces résultats nous confortent dans le choix de la voie de la recherche et le développement de nouvelles molécules inhibitrices de protéines de la réparation de l’ADN et en particulier RAD51.

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Chapitre 5 – Recherche de nouveaux inhibiteurs de