La réparation des cassures double-brin par la recombinaison homologue

La deuxième voie majeure de réparation des CDB est la recombinaison homologue. Elle prend place durant les phases S et G2 du cycle cellulaire. Cela s’explique par le fait que la recombinaison homologue nécessite la présence d’une copie d’ADN intacte et homologue à la zone lésée, ce qui est possible après la réplication. La RH se décompose en trois phases : la phase pré-synaptique, la phase synaptique et la phase post- synaptique (Figure 6).

1.5.4.1. La phase pré-synaptique

La première phase de la recombinaison homologue débute par la détection de la cassure et la résection des extrémités de la cassure. La résection engendre la création d’extrémités 3’-sortantes. Les principaux modèles récents proposés tendent à décrire deux étapes dans la résection de l’ADN. La première consiste en l’action de deux protéines, CtIP et MRN qui résectent l’ADN sur une courte distance. Lors de la deuxième étape, deux voies sont possibles, une première utilisant EXO1 et une seconde via le complexe BLM-RMI1-TOP3 et l’endonucléase DNA2. Quelle que soit la voie empruntée, cela aboutit à une résection sur une plus grande distance des extrémités de la zone lésée 67,68_.

La protéine RPA est impliquée dans ce phénomène de résection en stabilisant les structures d’ADNsb et en empêchant la formation de structures secondaires de l’ADN 69_.

RPA permet également l’initiation du point de contrôle en activant ATR menant ensuite à l’activation d’ATM. RPA joue également un rôle dans le recrutement de RAD51, la protéine centrale de la recombinaison homologue en inhibant l’arrivée de la protéine sur l’ADNsb.

Afin d’initier la réparation, cette inhibition doit être levée, et c’est le rôle de plusieurs protéines appelés médiateurs de RAD51, qui ont pour principal rôle d’aider RAD51 à se fixer à l’ADN au niveau de la cassure, puis de stimuler son activité par la suite. Les deux médiateurs de RAD51 sont BRCA2 et PALB2. Ces deux protéines forment un complexe avec la protéine BRCA1 afin d’amener RAD51 au niveau de la cassure 70–73_.

Chez certains organismes comme la levure Saccharomyces cerevisiae, une autre protéine joue un rôle primordial dans la phase pré-synaptique : Rad52. Ces organismes n’exprimant pas d’orthologues à BRCA2, c’est Rad52 qui possède les fonctions allouées

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à cette dernière et prend ainsi le titre de médiateur 74–77_{. Chez l’homme, le rôle que joue}

RAD52 dans le recrutement de RAD51 demande à être clarifier, et sa fonction principale reste l’hybridation de deux brins d’ADN 78_.

Cinq autres protéines sont impliquées dans le recrutement de RAD51 à la cassure, ce sont les paralogues de RAD51 : RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 et XRCC3

79–83_.

Il a été montré récemment qu’une autre protéine appelée DSS1 jouerait un rôle dans le recrutement de RAD51. Très étudiée chez le champignon parasite Ustilago

maydis, DSS1 est capable de lier Brh2, un orthologue de BRCA2, et de l’aider à se lier à

l’ADN, facilitant ainsi le recrutement et la liaison de Rad51 à l’ADN 84,85_{. Chez les}

mammifères, DSS1 est également capable d’aider BRCA2 et RAD51 à s’associer à l’ADN 86–88_{. Le mode d’action de DSS1 dans la formation du complexe RAD51-BRCA2-}

ADN n’est pas encore clair, mais des preuves récentes suggèrent que DSS1 lierait RPA en mimant la structure de l’ADN, permettant ainsi de libérer l’ADNsb recouvert par RPA au niveau de la cassure. L’ADN deviendrait ainsi accessible pour l’arrivée de RAD51 et la formation du nucléofilament 89_.

1.5.4.2. La phase synaptique

A la fin de la phase pré-synaptique, l’ADNsb issu de la résection est recouvert de RAD51, formant le filament pré-synaptique. Ainsi, ce dernier s’associe à l’ADNdb de la chromatide issu de la réplication par homologie de séquence, la recherche d’homologie constituant une des fonctions de RAD51. Cette association nécessite l’ouverture de la structure d’ADNdb matrice et son invasion par le nucléofilament, aboutissant à la formation d’une structure constituée de trois brins d’ADN appelée boucle de déplacement (ou D-loop pour « Displacement loop »). Durant cette phase, deux protéines participent à la formation de la D-loop, RAD54 et RAD51-AP1 90,91_.

1.5.4.3. La phase post-synaptique

La phase synaptique aboutit à la formation de la structure en D-loop de l’ADN, qui sert de base à la dernière étape de la recombinaison homologue, la phase post- synaptique. Durant cette phase, les polymérases synthétisent l’ADN à recopier au niveau de la cassure. Cette synthèse d’ADN génère des structures secondaires d’ADN qui sont

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résolues de deux manières différentes : par la voie d’hybridation de brin dépendant de la synthèse (ou SDSA pour « Synthesis-Dependent Strand Annealing ») ou par la voie DSBR (pour « Double-Strand Break Repair ») 92–94_{. Dans le premier modèle, celui de la}

SDSA, la structure en D-loop est éliminée, libérant ainsi le brin d’ADN envahissant. Celui-ci est réassocié, par homologie de séquence, à la seconde extrémité protubérante issue de la cassure. Ensuite, l’ADN est synthétisé au niveau de la cassure en utilisant le brin d’ADN récupéré comme matrice. La liaison entre les brins se fait et aboutit à la formation de deux ADNdb sans échange de matériel génétique. Dans le second modèle de DSBR, la présence de la D-loop associée à la synthèse d’ADN par les ADN polymérases engendrent la formation d’une structure d’ADN appelée jonction de Holliday. Dans ce modèle, la structure en D-loop est conservée et même étendue durant la synthèse d’ADN par les ADN polymérases jusqu’à la capture de la seconde extrémité d’ADN libre de la cassure. Cette dernière sert ensuite d’amorce à la synthèse d’ADN. Cette élongation de l’ADN aboutit à la création de la jonction de Holliday, structure en croix, formée par quatre brins d’ADN. Ces structures nécessitent d’être éliminées de l’ADN afin d’obtenir deux ADNdb intacts. Pour ce faire, il existe des nucléases capables de reconnaître les jonctions de Holliday et de les abolir, ce sont les résolvases. Actuellement, GEN1 95 _{et le complexe SLX1/SLX4} 96,97 _{ont été identifiés et classés}

comme des résolvases chez les eucaryotes. Des hélicases, comme les protéines WRN et BLM de la famille des hélicases RecQ, interviennent également dans le processus 98,99_{. A}

la différence de la voie SDSA, ce modèle-ci peut mener à un échange d’information génétique (« crossing-over ») entre les deux matrices d’ADNdb.

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Figure 6 - Les différentes étapes de la recombinaison homologue et les structures de l’ADN associées.

La recombinaison homologue se décompose en trois phases. Une fois la cassure détectée, une étape de résection de l’ADN aboutit à la création d’extrémités 3’-sortantes de part et d’autre de la cassure, c’est la phase pré-synaptique. Une des extrémités ainsi formées envahit la matrice d’ADNdb complémentaire à la zone lésée. Cette étape est appelée phase synaptique et aboutit à la formation d’une structure d’ADN triple brin appelée boucle de déplacement (D-loop, displacement-loop). La réparation de la cassure est ensuite effective durant la troisième et dernière phase de la recombinaison homologue : la phase post-synaptique. Deux voies de résolution existent : la réparation des CDB (DSBR) et l’hybridation de brins dépendant de la synthèse (SDSA). La DSBR nécessite la capture de la seconde extrémité 3’-sortante de la cassure suite à l’agrandissement de la D-loop aboutissant à la formation de jonctions de Holliday. Ces structures sont résolues pour aboutir à la formation de deux ADNdb avec ou sans crossover. La SDSA débute par le désassemblage de la D-loop, libérant ainsi l’extrémité 3’-sortante utilisée pour l’invasion. Ce brin d’ADN s’associe avec la seconde extrémité sortante de la cassure par homologie. Une synthèse d’ADN est ensuite nécessaire afin de combler la région lésée et former un ADNdb intact sans échange d’ADN avec l’ADNdb matrice. (Adapté de 424₎

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Figure 7 – Les principales protéines associées aux différentes étapes de la recombinaison homologue.

1.5.5. La réparation des cassures double-brin par l’hybridation simple-brin