Structure des domaines CP

Les domaines CP1 des LeuRS, IleRS et ValRS ont des séquences et des structures homologues (Fukunaga and Yokoyama, 2005a). Le domaine CP1 est inséré dans le corps principal de l’enzyme et connecté à l’enzyme par 2 brins β, le site d’édition étant situé à près de 30 Å du site d’aminoacylation. Les domaines CP1 des LeuRS bactériennes et mitochondriales ont un point d'insertion légèrement différent de celui des IleRS, ValRS et LeuRS archéennes (Cusack et

al., 2000). Il en résulte une différence entre l'orientation de ce domaine dans la

LeuRS et dans l'IleRS, par exemple de T. thermophilus (voir figure 9), ce qui fait que, pour accéder aux sites d'édition, les extrémités 3' des ARNt doivent être dans des positions différant par une rotation de près de 180°.

a) b)

Figure 9 : Structures tridimensionnelles de la LeurRS et de l'IleRS de T.

thermophilus

Les structures cristallographiques de la LeuRS (a) (code PDB 1OBC) et de l'IleRS (b) (code PDB 1ILE) sont représentées ci-dessus à l'aide du logiciel Pymol. Le corps principal des enzymes est représenté en gris et les domaines d'éditions en cyan (a) et magenta (b), les deux brins β liant les domaines CP1 au reste de l'enzyme sont représentés en rouge (a) et jaune (b).

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65 c c

a b d e

Les sites catalytiques des domaines d'édition des LeuRS, IleRS et ValRS possèdent aussi de nombreuses similarités, comme on peut le voir sur l’alignement ci-dessous.

Figure 10 : Alignement des domaines CP1

D'après Fukunaga et Yokoyama (2005b). Deux régions de la séquence des ValRS, LeuRS et IleRS, sont alignées pour différents organismes : T. thermophilus, Aquifex aeolicus, E. coli, S. cerevisiae et Homo sapiens. Les résidus indiqués possèdent des particularités détaillées dans le texte :

a. Région riche en thréonines formant un réseau de liaisons hydrogène avec le substrat. b. Motif GTG et deux résidus en interaction avec l'adénine du substrat.

c. Résidus impliqués dans la spécificité du site d'édition.

d. Acide aspartique conservé dans les ValRS et certaines LeuRS. Il interagit avec le groupement hydroxyle du substrat.

e. Acide aspartique catalytique universellement conservé.

Dans la région centrale, ces domaines possèdent un acide aspartique (figure 10.e) universellement conservé, qui forme un pont salin avec le groupement amino du substrat. La mutation de cet acide aspartique supprime l’activité d’édition de l’IleRS, de la ValRS et de la LeuRS (Dock-Bregeon et al., 2004 ; Fukunaga et al., 2004 ; Fukunaga and Yokoyama, 2005a ; Lincecum et al., 2003).

Une région riche en thréonines (figure 10.a) est conservée dans ces trois enzymes. Des mutations simultanées de plusieurs de ces thréonines suppriment l'activité d'édition de l'IleRS et de la LeuRS de T. thermophilus (Fukunaga et al., 2004 ; Zhai and Martinis, 2005). Dans la structure cristallographique du complexe entre la LeuRS de T. thermophilus et la 2'-(L-norvalyl)amino-2'-désoxyadénosine (un analogue du substrat de l'édition post-transfert), deux thréonines conservées de cette région (T247 et T248) participent à un réseau de liaisons hydrogène stabilisant l’état de transition de la réaction d'édition (Lincecum et al., 2003 ; Zhai and Martinis, 2005).

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Ce réseau de liaisons hydrogène implique également le groupement 3'-OH du ribose du ligand et le groupement carbonyle de l'acide aminé (Lincecum et al., 2003). Ce groupement 3'-OH est aussi stabilisé dans la ValRS de T. thermophilus par une liaison hydrogène avec la chaîne latérale de l’Asp276, conservé dans les domaines CP1 des ValRS et de certaines LeuRS (Fukunaga and Yokoyama, 2005b)(figure 10.d). La stabilisation du groupement 3’-hydroxyle de l’ARNt par des liaisons hydrogène pourrait lui permettre de jouer un rôle dans la catalyse de la réaction, en lui donnant la possibilité d’activer une molécule d’eau au voisinage du site de coupure (voir figure 11). Ceci est d’autant plus vraisemblable que des expériences de mutagenèse dirigée systématique dans le site d'édition de la LeuRS n’ont pas permis d’identifier un résidu catalytique pouvant activer cette molécule d’eau (Nordin and Schimmel, 2002). Des calculs énergétiques ont d’ailleurs confirmé récemment cette hypothèse, qui confère donc à l’ARNt un rôle de ribozyme puisqu’il conduit lui-même la réaction catalytique (Hagiwara et al., 2010).

Figure 11 : Site d'édition de la LeuRS de T. thermophilus

La structure cristallographique du site d'édition de la LeuRS de T. thermophilus en complexe avec un analogue du substrat d'édition post-transfert, la 2'-(L-norvalyl)amino-2'-désoxyadénosine, est représentée ci-dessus à l'aide du logiciel Pymol et à partir du fichier PDB : 1OBC. L'analogue du substrat est représenté en magenta. Son groupement 3'-OH participe à un réseau de liaisons hydrogène (en pointillé) avec les thréonines 247 et 248, (représentées en vert), et permet la stabilisation d'une molécule d'eau dans le site d'édition. L'acide aspartique universellement conservé au sein des domaines CP1 (Asp347) est représenté en bleu. La tyrosine (Tyr332) et l'isoleucine (Ile337) prenant l'adénine du substrat en sandwich sont représentées en cyan ainsi que le motif GTG aux extrémités duquel elles se trouvent. La thréonine (Thr252), la valine (Val340) et la méthionine (Met338) jouant un rôle dans la reconnaissance spécifique du substrat sont représentées en orange.

Par ailleurs, une boucle comportant un motif GTG (figure 10.b), très conservé dans les domaines CP1, intervient pour positionner, dans le site d'édition, l’adénosine de l’extrémité 3’ de l’ARNt mésaminoacylé (Fukunaga and Yokoyama, 2005b ; Lincecum et al., 2003). Ainsi, dans la LeuRS de T.

thermophilus, deux résidus voisins de cette boucle, la Tyr332 et l'Ile337, prennent H2O

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67 en sandwich l'adénine terminale de l'ARNt. Dans la ValRS de T. thermophilus, les résidus équivalents, la Phe264 et la Leu269, ont le même rôle. Les interactions sont possibles grâce aux deux glycines du motifs GTG, qui adoptent des conformations que ne pourraient prendre les autres acides aminés (Lincecum et

al., 2003). Dans le cas de l'IleRS de T. thermophilus, l'adénine interagit via des

liaisons de van der Waals avec la Val318, qui est le résidu équivalent à l'Ile337 de la LeuRS et à la Leu269 de la ValRS. Dans l'IleRS, il n'y a pas de résidu aromatique comparable à la Tyr332 et à la Phe264 des LeuRS et ValRS. Par contre, il existe des liaisons hydrogène entre les atomes N1 et N6 de la base et différents groupements du squelette peptidique (Fukunaga and Yokoyama, 2006).

D’autres résidus, conservés différemment entre les synthétases, contribuent à la spécificité de celles-ci envers les divers acides aminés. Ainsi, la Lys270 et la Thr272 (figure 10.c) de la ValRS de T. thermophilus, strictement conservées dans les ValRS mais pas dans les LeuRS ou les IleRS, interagissent avec le groupement hydroxyle de la chaîne latérale de la thréonine éditée, mais pas avec la valine qui ne possède pas de groupement hydroxyle (Fukunaga and Yokoyama, 2005b). La mutation de cette lysine chez E. coli (Lys277) rend possible l’hydrolyse du Val-ARNtVal (Hountondji et al., 2002), ce qui indique que cette lysine sert aussi à repousser la valine et sa chaîne latérale hydrophobe.

Dans les IleRS, on trouve systématiquement une histidine à la position occupée par la Lys270 dans la ValRS de T. thermophilus. Sur la structure de l’IleRS de T. thermophilus complexée avec la L-valine (Fukunaga et al., 2004), on constate que cette histidine empêcherait, par gêne stérique, la fixation de l’isoleucine dans le site d’édition (Fukunaga et al., 2004). En accord avec cette conclusion, la mutation de cette histidine chez E. coli rend l'IleRS capable d'hydrolyser l'Ile-ARNtIle _{(Hendrickson et al., 2002). Ce résultat a aussi été}

observé chez T. thermophilus pour cette histidine (His379), mais aussi pour une thréonine (Thr233) appartenant à la région riche en thréonine de l'IleRS, qui participe donc aussi à la spécificité de l'IleRS (Fukunaga and Yokoyama, 2006).

Dans la LeuRS de T. thermophilus, la Thr252 (conservée dans le motif riche en thréonine de tous les domaines CP1), la Met338 (spécifique de certaines LeuRS) et la Val340 (spécifique de toutes les LeuRS) forment une cavité trop petite pour accepter la leucine, mais dans laquelle les acides aminés édités (Ile et Met essentiellement) sont stabilisés par un réseau de liaisons hydrogène (Liu et

al., 2006 ; Zhai et al., 2007).

Ainsi, certains résidus interagissent directement avec les substrats des sites d'édition tandis que d’autres empêchent l'acide aminé correct de se fixer dans ce site, souvent pour des raisons stériques. Ceci est à rapprocher du double criblage qui a été évoqué pour décrire la façon dont ces synthétases sélectionnent l'acide aminé qui leur correspond. Un premier criblage est effectué au niveau du site d'activation, qui élimine les acides aminés plus gros que l'acide aminé correct. Un deuxième criblage est effectué au niveau du site d'édition qui, au contraire, n'accepte que les acides aminés plus petits que l'acide aminé correct.

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2.3 L’édition par les aminoacyl-ARNt synthétases de

classe II

Si les enzymes de classe I possèdent un site d’édition assez similaire, les enzymes de classe II qui catalysent une réaction d’édition utilisent pour cela des domaines structuralement très différents.

Pour les enzymes de classe II, des études ont montré que la ProRS, la ThrRS, l’AlaRS et la PheRS possèdent des activités d’édition que nous allons détailler ci-dessous. La LysRS de classe II semble aussi avoir une activité d’édition, mais uniquement pré-transfert, via un mécanisme de cyclisation similaire à celui de la MetRS. Il a vraisemblablement lieu dans le site où se fait l’activation de l’acide aminé (Ataide and Ibba, 2004 ; Jakubowski, 1997, 1999). Il permet à la LysRS, qui est capable d’activer l’ornithine, d’éviter que celle-ci ne soit transférée sur l’ARNtLys. Il semble qu’après activation de l’ornithine, le groupement NH3+ de la chaîne latérale de cet acide aminé soit capable d’attaquer

le groupement carbonyle de l’ornithyl-adénylate, ce qui conduit à la formation d’un composé cyclique.

Figure 12 : Edition pré-transfert de l'ornithine par la LysRS de classe II D'après Jakubowski (1999). L'édition pré-transfert de l'ornithyl-adénylate par la LysRS de classe II conduit, par cyclisation, à la formation d'ornithyl-lactame, en libérant l'AMP.

2.3.1 L’édition pour les ARNt