La peptidyl-ARNt hydrolase archéenne

Des recherches dans les banques de séquences montrent que, chez les archées, il n’existe aucun gène présentant des homologies significatives avec les PTH bactériennes. Les archées ne sont cependant pas dépourvues d’activité PTH, mais elles expriment une PTH (PTH2) dont la séquence est très différente de celles des PTH bactériennes. La protéine PTH2 est néanmoins fonctionnellement interchangeable avec la PTH bactérienne PTH1, puisque l’expression de PTH2 chez E. coli permet de complémenter l’absence de PTH endogène (Fromant et al., 2003 ; Rosas-Sandoval et al., 2002).

5.2.1 Spécificité du substrat de PTH2

Comme la PTH bactérienne, la PTH archéenne hydrolyse les aminoacyl- ARNt dont le groupement N-terminal de l’acide aminé est bloqué (Rosas- Sandoval et al., 2002). Si l’acide aminé n’est pas bloqué, la vitesse d’hydrolyse est 200 fois plus faible (Fromant, M., Plateau, P., Blanquet S., résultats non publiés). Les Met-ARNtMet initiateurs des archées ne sont pas formylés et ne possèdent pas le mésappariement C1-A72 décrit ci-dessus (Bult et al., 1996). La PTH archéenne n'a donc pas à exclure le fMet-ARNtfMet. Ainsi, contrairement à la PTH bactérienne, la PTH archéenne est capable d’hydrolyser le fMet-ARNtfMet. Les mécanismes de reconnaissance des ARNt par les PTH bactérienne et archéenne sont donc différents.

Par ailleurs, l’ARNt non aminoacylé est un inhibiteur bien plus efficace pour l’activité de la PTH2 que pour celle de la PTH1 (il existe un facteur supérieur à 100 entre les 2 KI (Fromant et al., 2003)), ce qui suggère que la PTH

archéenne possède des interactions plus fortes avec les ARNt ou la partie ARNt des peptidyl-ARNt.

5.2.2 Structure et mécanisme des PTH archéennes

Bien que les PTH2 n’aient été découvertes qu’en 2002 (Fromant et al., 2003 ; Rosas-Sandoval et al., 2002), plusieurs structures de PTH de type 2 ont été résolues par cristallographie ou par RMN. On dispose ainsi de celles des PTH2 de

Sulfolobus solfataricus (code PDB 1XTY) (Fromant et al., 2005), de Thermoplasma acidophilum (code PDB 1RLK), d’Archaeoglobus fulgidis (code

PDB 1RZW) (Powers et al., 2005), de Pyrococcus horikoshii (code PDB 2D3K) (Shimizu et al., 2008), de Methanocaldococcus jannaschii (code PBD 2ZV3), ainsi que de la structure d’une protéine humaine (Bit1) homologue aux PTH archéennes (code PDB 1Q7S) (De Pereda et al., 2004). Toutes ces structures sont très proches les unes des autres. Ces protéines forment un dimère symétrique, chaque protomère étant constitué d’un feuillet β entouré de deux groupes de deux

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109 hélices alpha (voir figure 23). L’interface des deux sous-unités est formée par des contacts de van der Waals entre des résidus hydrophobes de l’hélice α1 de chaque protomère, très conservés dans les PTH2, notamment A20, A24, A27, V28, V31, I135 et K16, via la partie aliphatique de sa chaîne latérale (numérotation S.

solfataricus).

Comme pour la PTH1, aucune structure du complexe entre la PTH2 et son substrat n’a été obtenue à ce jour. Les mécanismes de reconnaissance et d’hydrolyse du substrat ne sont donc pas encore totalement élucidés. Cependant, un certain nombre de résidus très conservés (K18, Q22, H25, K56, D86, T90 et T98 chez S. solfataricus) (Fromant et al., 2005) sont regroupés dans une région comprenant l’extrémité N-terminale de l’hélice α1 et la boucle entre le feuillet β3 et β4 d’un protomère, ainsi que les brins β2 et β5 de l’autre protomère. Lorsque ces résidus sont mutés en alanine, l’activité de la PTH2 est réduite, ce qui montre que cette région correspond vraisemblablement au site actif.

Figure 23 : Structure de la PTH archéenne

Représentation à l’aide du logiciel Pymol, de la structure cristallographique de la PTH de S. solfataricus (code PDB 1XTY). Le protomère A est colorié en vert et le protomère B en rouge. Les chaînes latérales de résidus conservés (K18, Q22, H25, K56, D86, T90 et T98) sont représentées en bleu foncé pour le protomère A et en bleu clair pour le protomère B.

Les résidus K18, D86 et T90 semblent jouer un rôle prépondérant dans le mécanisme catalytique puisque la vitesse des PTH2 où ces résidus sont mutés en alanine est réduite de deux (pour T90) à trois ordres de grandeur (pour K18 et D86), alors que le Km pour le diacétyl-Lys-ARNtLys est peu affecté (Fromant et

al., 2005). K18 et D86 pourraient jouer un rôle via leurs fonctions acido-basiques

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La proximité des résidus K18 et D86, dont les chaînes latérales interagissent via un pont salin, et le fait que le double mutant KA18-DA86 n’est pas plus affecté que les simples mutants, suggèrent que D86 pourrait diminuer la valeur du pKa de

K18, ce qui renforcerait sa réactivité pour l’attaque du groupement carbonyle de la liaison ester du substrat. Cette activation pourrait rappeler l’activation de H20 par D93 dans la PTH d’E. coli, mais la ressemblance de ces sites actifs s’arrête là, puisqu’ils sont structuralement très différents et qu’on ne retrouve pas ici les asparagines qui interagissent chez E. coli avec la partie peptidique du substrat.

Dans les cristaux de la PTH2 de S. solfataricus et de T. acidophilum, un ion sulfate semble se loger au voisinage du site actif, stabilisé par les chaînes latérales de Q22, de D86 (via une molécule d’eau), de K56 (via deux molécules d’eau) et par le groupement amide de A87. Cet ion sulfate pourrait mimer un phosphate de l’extrémité CCA du substrat qui serait ainsi stabilisé dans le site actif.

La forte concentration de résidus chargés positivement sur une face de la PTH2, au voisinage de ce site actif, pourrait jouer un rôle dans la forte fixation de l’ARNt sur la PTH2, mais cela reste à confirmer. Par contre, à la différence de la PTH1 où le phosphate de l’extrémité 5’ de l’ARNt est spécifiquement reconnu par une pince formé de deux résidus basiques très conservés (R133 et K105 chez E.

coli), aucun résidu basique pouvant jouer ce rôle n’est conservé à la surface de la

PTH2. On peut d’ailleurs noter que le Km de la PTH2 pour un diacétyl-Lys-

ARNtLys déphosphorylé est légèrement inférieur à celui d'un diacétyl-Lys-ARNtLys possédant un phosphate en 5’ (Fromant et al., 2003), ce qui indique que ce phosphate n'a pas le rôle important qu'il joue dans l'interaction avec PTH1.

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