Modélisation de l’interaction entre la PTH et le duplex His

4.1.1 Paramètres de la modélisation

Nous avons cherché à construire un modèle du complexe entre la protéine et le duplex. Pour cela, nous nous sommes servis d’un ensemble de scripts écrit pour CNS. Un ensemble de scripts similaires, élaboré par François Bontems, avait déjà été utilisé pour étudier la fixation de la thymosine β4 sur de l’actine (Domanski et al., 2004). Tout comme HADDOCK, (utilisé ci-dessus pour l’étude de l’interaction entre la PTH et la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine), il permet de faire évoluer un système vers un minimum d’énergie en prenant en compte des contraintes d’interactions, mais il était plus simple et plus rapide à mettre en place qu’HADDOCK pour cette étude de l’interaction entre la PTH et le duplex et, surtout, pour la modélisation que nous allons faire également de l’interaction entre la PTH et un duplex aminoacylé et acétylé.

Nous sommes partis de la structure cristallographique de la PTH sauvage (contenant l'histidine 20) à laquelle nous avons ajouté les atomes d’hydrogène manquants, et de la structure du duplex construite grâce au logiciel XDNA.

Une liste de "contraintes floues" a été définie à partir d'une liste de résidus de la protéine affectés par la liaison au duplex (chaque contrainte spécifiant qu'un résidu de cette liste doit être au contact du duplex). Les résidus choisis sont ceux qui, sur l'expérience HSQC réalisée avec un rapport ARN/PTH H20A de 0,4, ont un IPI supérieur à 0,8 ou un delta supérieur à 0,02 ppm et qui sont à la surface de la protéine, c'est-à-dire les résidus suivants : 20, 67, 68, 96, 105, 110, 114, 117, 133, 141, 142, 145, 149, 182, 184, 186, 189 et 191. Cette liste a été utilisée pour construire un ensemble de modèles du complexe protéine/duplex en donnant une pénalité de 10 kcal.mol–1.Å–2 à chaque fois que la distance entre un résidu de la liste et l’ARN était supérieure à 4 Å.

4.1.2 Modélisation sans orientation préalable

Dans un premier temps, le duplex était éloigné de la protéine en face de la région affectée, à une distance variable comprise entre 10 et 30 Å et avec une orientation variable. 100 positions de départ aléatoires ont permis d'obtenir 100 modèles de complexe.

L’énergie totale de chacun de ces modèles a ensuite été calculée, ainsi qu’un terme d'énergie de contraintes qui reflète le non-respect des contraintes floues imposées. Trois solutions avec le meilleur compromis entre l'énergie totale et l'énergie liée au contraintes ont été retenues (voir figure 50). Dans ces trois modèles, l'ARN est bien en contact avec la zone d’interaction prédite par

Chapitre 4 : Modélisation de l'interaction entre la PTH et son substrat __________________________________________________________________ 190 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 -1500 -1000 -500 0 500 1000

l'expérience de RMN, et l'ARN s’oriente avec son extrémité 3’ du côté du site actif de la PTH dans deux de ces modèles dont celui représenté sur la figure 51. Dans le troisième, l’orientation de l’ARN est inverse, avec l’extrémité CCA éloignée du site actif.

Figure 50 : Energies des modèles de complexes entre la PTH et le duplex obtenus sans orientation préalable

Pour chacun des 100 modèles obtenus, un losange bleu indique l’énergie totale (en abscisse) et l’énergie liée aux contraintes floues (en ordonnée). Les 3 solutions retenues sont entourées en rouge.

Figure 51 : Complexe entre la PTH et le duplex sans orientation préalable Représentation d’un des meilleurs modèles du complexe entre la PTH et le duplex. Les résidus de la liste de contraintes floues utilisées pour l’obtention de ce modèle sont colorés en vert, le duplex avec son extrémité 3’ à gauche est en rouge et la protéine en gris. Les deux représentations montrent la même vue du complexe en mode « cartoon » et surface, respectivement.

Site actif

Région de la pince K105-R133

Hélice C- terminale

Chapitre 4 : Modélisation de l'interaction entre la PTH et son substrat __________________________________________________________________

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4.1.3 Modélisation avec orientation préalable du duplex

Pour pouvoir faire converger nos modèles rapidement vers les complexes d'énergie minimale, nous avons relancé une série de 100 calculs en positionnant à nouveau le duplex à une distance variable de la protéine (20 ±10 Å), mais en partant toujours d'une orientation identique à celle du meilleur modèle obtenu ci- dessus. Les 4 solutions présentant le meilleur compromis entre l'énergie totale et l'énergie liée aux contraintes floues(entourées sur la figure 52) sont présentées sur la figure 53.

Figure 52 : Energies des modèles de complexes entre la PTH et le duplex obtenus avec une orientation préalable du duplex

Pour chacun des 100 modèles obtenus, un losange bleu indique l’énergie totale (en abscisse) et l’énergie liée aux contraintes floues (en ordonnée). Les 4 solutions retenues sont entourées en rouge.

Figure 53 : Structure des modèles de complexes entre la PTH et le duplex obtenus avec une orientation préalable du duplex

La structure de la PTH est représentée en gris. Les positions du duplex dans les quatre meilleurs modèles (entourés sur la figure 52) sont représentées avec quatre couleurs également utilisées pour représenter les chaînes latérales de H20, K105, R133 et K182.

2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 -1800 -1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 H20 R133 K105 K182 Extrémité 5’ du duplex Extrémité 3’ du duplex

Chapitre 4 : Modélisation de l'interaction entre la PTH et son substrat __________________________________________________________________ 192 H20 - O3' K105 – O5’ R133 – O5’ K182 - OP 1 2,55 2,38 3,33 2,22 2 8,78 3,99 7,6 2,21 3 8,09 4,99 7,58 2,22 4 8,7 7,35 2,228 2,89

Tableau 11 : Distances entre le duplex et la protéine dans les quatre meilleurs modèles obtenus

Toutes les distances sont données en Å. La 2ème _{colonne indique la distance entre le O} 3' de

l’adénosine 3’-terminale du duplex et le Nε de l’histidine 20 de la PTH. La 3ème _{colonne indique la}

distance entre un Hζ de K105 et un atome d’oxygène du groupement phosphate +1 du duplex. La 4ème _{colonne indique la distance entre un H}η _{du groupement guanidium de R133 et un atome}

d’oxygène du groupement phosphate +1 du duplex. La 5ème _{colonne indique la distance entre un H}ζ

de K182 et un atome d’oxygène d’un groupement phosphate du duplex. Pour le modèle 1, le groupement phosphate le plus proche de K182 est celui porté par la guanosine 53 du duplex (selon la numérotation de l’ARNtHis_{) qui correspond à la dernière base en amont (du côté 5’) de la boucle}

TψC d’un ARNt. Pour les modèles 2, 3 et 4, le groupement phosphate le plus proche de K182 est porté par la cytidine 52 du duplex.

Dans l’ensemble de ces modèles, i) l'extrémité 3'-acceptrice de l'ARN se positionne dans la région du site actif de l'enzyme, au voisinage de l’histidine 20 qui est le résidu catalytique le plus important (voir tableau 11), ii) le phosphate +1 de l’ARN se trouve proche des résidus Lys105 et Arg133, ce qui est en accord avec l’existence d’une pince formée par les chaînes latérales de ces résidus, autour de ce phosphate, iii) l'hélice C-terminale de la protéine se positionne dans le grand sillon du bras TψC, où le groupement amino de K182 est situé à moins de 3 Å d'un groupement phosphate de l'ARN. Dans le modèle 1, ce phosphate est celui de la guanosine 53 (selon la numérotation de l’ARNtHis). Dans les modèles 2, 3 et 4, il s’agit du phosphate de la cytidine 52. Les modèles obtenus sont compatibles avec l’ensemble des résultats fournis par la RMN, ce qui confirme la pertinence de l’interaction entre la PTH et le duplex décrite par ces modèles.

Du côté du site actif, on aurait pu s’attendre à retrouver un empilement de l’adénine 3’-terminale de l’ARNt sur F66 et une interaction entre le 5’-phosphate de l’adénosine 76 et Y15, comme nous avons conclu dans le cas de la diacétyl- Lys-(3’NH)-adénosine, mais cette possibilité ne semble pas avoir été exploitée par notre programme. Vu le positionnement du duplex sur nos modèles, il semble cependant possible d’obtenir de telles interactions en modifiant seulement la conformation de l’extrémité CCA du duplex, sans toucher au reste de la molécule.

Chapitre 4 : Modélisation de l'interaction entre la PTH et son substrat __________________________________________________________________

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