Construction des modèles

Pour obtenir un modèle du complexe entre la protéine et la diacétyl-Lys- (3’NH)-adénosine, le programme HADDOCK (High Ambiguity Driven

biomolecular DOCKing) a été mis en œuvre (Dominguez et al., 2003). Pour

définir la structure d’un complexe protéine–ligand, ce logiciel utilise des données énergétiques intra- et intermoléculaires, mais également des données expérimentales comme, par exemple, celles qui sont fournies par des expériences de RMN. Un de ses gros avantages est qu’il permet de définir des contraintes floues spécifiant qu’une liste choisie de résidus de la protéine est en contact avec le ligand, mais ne spécifiant pas précisément ces contacts.

Comme on l’a vu ci-dessus, les expériences de RMN indiquent que les pics HN-N de 10 résidus de la PTH se déplacent d’une distance Δ supérieure à 0,02 ppm en présence de diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine. Cette variation de déplacement chimique reflète soit un contact direct entre le ligand et le résidu de la protéine auquel appartiennent ces atomes N et HN, soit une perturbation structurale de ce résidu induite par un contact entre le ligand et un autre résidu. Comme il était difficile de savoir a priori laquelle de ces deux hypothèses était la bonne, nous avons tout d’abord inclus, dans la liste des résidus devant être au contact du ligand, l’ensemble des résidus fortement affectés par la présence de diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine : N10, M67, N68, G111, N114, L116, K117, G147, F148 et V149.

Pendant une première minimisation énergétique en corps-rigide, le programme a généré 1000 modèles et les 200 modèles avec l’énergie d’interaction intermoléculaire la plus basse ont été utilisés par HADDOCK pour l’affinement semi-flexible.

Les 200 modèles affinés comportent un grand nombre de disparités, ce qui reflète vraisemblablement l’impossibilité pour la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine de se fixer sur la protéine en respectant toutes les contraintes imposées. En particulier, les résidus G111 et K117, excentrés par rapport aux autres (en jaune sur la figure 35), ne sont en contact avec le ligand que dans 10 et 27 modèles, respectivement. Cette sous-représentation des contacts entre le ligand et ces deux résidus suggère que ces résidus ne sont pas en contact direct avec le ligand et que les variations de leurs déplacements chimiques résultent d’un réarrangement structural. Cette conclusion est compatible avec une ouverture du site actif, lors de l’occupation de celui-ci, telle qu’elle a été suggérée par Selvaraj et al. (Selvaraj et

Chapitre 2 : Caractérisation de l’interaction entre la PTH et un analogue de son

substrat, la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine

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Pour améliorer la cohérence des modèles obtenus, nous avons donc réalisé un deuxième calcul en supprimant les contraintes sur G111 et K117. Les 200 modèles obtenus après affinement possèdent encore des différences mais la variabilité est nettement plus faible qu’après la première série de calculs. On retrouve d’ailleurs une même orientation de la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine sur la PTH dans environ 50% des modèles, dont celui possédant le meilleur score HADDOCK. Ce score HADDOCK prend en compte, pour chaque modèle, à la fois l’énergie totale d’interaction du complexe et le respect des contraintes floues. La proportion des modèles ayant cette orientation est plus grande encore lorsque l’on considère ceux qui ont les meilleurs scores puisqu'elle atteint 80% pour les 50 meilleurs modèles. Nous avons donc retenu les 20 modèles possédant les meilleurs scores pour les étudier en détail.

Pour 19 de ces 20 modèles, dont celui représenté sur la figure 35 qui possède le meilleur score HADDOCK, la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine se positionne dans le site actif putatif de la PTH avec son adénine au voisinage de F66 et l’extrémité de la chaîne latérale de sa lysine acétylée au voisinage de N114. On peut noter que cette orientation correspond aussi au modèle possédant le meilleur score dans la première modélisation réalisée, incluant les contraintes sur G111 et K117. Dans ces 19 modèles, la position du carbone C' (voir figure 31) du groupement carbonyle de la liaison amide entre l’adénosine et la lysine diacétylée est constante. La distance moyenne de ce carbone à celui dans le modèle possédant le meilleur score est de 1,2 Å (avec un écart-type de 0,75 Å) (voir tableau 7, dernière colonne). Un seul parmi les 20 modèles est orienté dans le sens opposé, avec l’adénine très éloignée de F66. Comme on ne retrouve une telle orientation que dans une dizaine d’autres modèles sur les 200 calculés, nous ne nous y sommes pas intéressés davantage.

Figure 35 : Modèle du complexe entre la diacétyl- Lys-(3’NH)-adénosine et la PTH

Pour le modèle possédant le meilleur score HADDOCK, la protéine est représentée en gris à l’aide du logiciel Pymol (en mode cartoon). Les chaînes latérales des résidus de la liste de contraintes floues utilisée dans le deuxième calcul HADDOCK sont représentées en magenta, celles de G111 et K117 sont représentées en jaune et celles de F66 et Y15 en vert. La diacétyl-Lys-(3’NH)- adénosine est représentée en cyan.

Chapitre 2 : Caractérisation de l’interaction entre la PTH et un analogue de son

substrat, la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine

153 Dans ces 19 modèles, nous avons ajouté la chaîne latérale de l'histidine 20 à la position qu'elle occupe dans la structure cristallographique de la PTH d'E. coli. A l'exception de 2 modèles, la position du ligand est clairement compatible avec la présence d'un résidu d'histidine, même s’il n'avait pas été inclus dans notre calcul réalisé avec le variant H20A. A titre d’exemple, la figure 36 montre la position de l’histidine 20 dans le cas du modèle possédant le meilleur score HADDOCK.

Figure 36 : Positions relatives de l’histidine 20 et de la diacétyl-Lys-(3’NH)- adénosine

La chaîne latérale de l'histidine 20 (en rouge) a été rajoutée sur le modèle du complexe entre la diacétyl-Lys-(3’NH)-adénosine (en cyan) et la PTH (en gris) possédant le meilleur score HADDOCK. L'orientation de la structure de la PTH est la même qu'à la figure 35.