Structure de l'AMPK

L'AMPK est une kinase très conservée au cours de l'évolution puisqu'elle est présente dans l'ensemble des organismes eucaryotes tels que les animaux, les plantes, les protistes et les levures (Hardie, 2008). On retrouve notamment des orthologues de l'AMPK nommés Snf1 (Sucrose nonfermenting 1) et Snf4 (Sucrose nonfermenting 4) chez la levure Saccharomyces cerevisiae (Celenza and Carlson, 1986)(Woods et al., 1994). L'AMPK correspond à un hétérotrimère composé d'une sous-unité catalytique α et de deux sous-unités régulatrices β et γ existant toutes les trois sous différentes isoformes (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2 et γ3). Chez les mammifères, chacune de ces isoformes est codée par un gène distinct (Prkaa1, Prkaa2, Prkab1, Prkab2, Prkag1, Prkag2 et Prkag3) pouvant ainsi mener théoriquement à la formation de 12 complexes hétérotrimériques différents dont les profils d'expression tissulaire et de localisation subcellulaire varient en fonction de leur composition (Gao et

al., 1996). Depuis plusieurs années, la réalisation d'étude cristallographique sur la structure de l'AMPK

a permis de déterminer avec une plus grande précision les différents domaines qui composent l'ensemble de ces différentes sous-unités ainsi que leur rôle dans la régulation allostérique de l'AMPK par les différents adénosines nucléotides (Figure 21).

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La sous-unité α contient dans sa partie amino-terminale (N-ter) le domaine catalytique sérine/thréonine kinase qui correspond à la partie hautement conservée de l'enzyme et qui est suivi d'un domaine d'auto-inhibition (AID). La sous-unité α possède également un motif d'interaction avec les deux sous-unités régulatrices nommé α-linker. Ce dernier est constitué de deux domaines : α-RIM1 et α-RIM 2 qui jouent tous les deux un rôle essentiel dans la régulation allostérique de l'AMPK (que

nous détaillerons dans la partie 3.1.) (Xin et al., 2013). L'extrémité carboxy-terminale (C-ter) possède

quant à elle, une région nommée α-CTD qui est nécessaire pour son association aux sous-unités β et γ (Crute et al., 1998) ainsi qu'une séquence d'exportation nucléaire (Kazgan et al., 2010). Cette dernière présente une séquence similaire entre les deux isoformes α1 et α2 et joue un rôle important dans la régulation de la localisation intracellulaire de l'AMPK. De plus, plusieurs sites de phosphorylation ont

Figure 21 : Structure crystallographique de l’AMPK sous sa forme phosphorylée et non phosphorylée. (a) Schéma représentant les différentes régions de l’hétérotrimère α1β2γ1 de l’AMPK. (b)

Représentation graphique de l’AMPK crystallisée et liée à la cyclodextrine, un activateur de l’AMPK, montrant l’orientation des différentes sous-unités de l’AMPK visualisées dans le panel (a). (c) Représentation graphique de l’AMPK crystallisée et liée à l’AMP. AID : domaine d’autoinhibition ; α-RIM : motif d’interaction à la sous-unité régulatrice β-ID : domaine d’interaction à la sous-unité β, α/γ-ID : domaine d’interaction aux sous-unités α/γ. (Modifié d’après Li et al., 2014)

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été identifiés sur la sous-unité catalytique de l'AMPK dont le résidu thréonine 172 qui comme nous le verrons par la suite, joue un rôle essentiel dans l'activation de cette kinase (Xiao et al., 2013)

Tout comme la précédente, la sous-unité β possède également dans sa partie carboxy- terminale un domaine β-CTD ainsi qu'une boucle β assurant l'interaction avec la partie α-CTD de la sous-unité α et la sous-unité γ respectivement. Ce domaine C-terminal joue un rôle crucial dans la régulation de l'activation de l'AMPK puisqu'il permet d'assurer la formation d'un complexe hétérotrimérique stable et fonctionnel (Hudson et al., 2003 ; Polekhina et al., 2003). La sous-unité β présente aussi dans sa partie centrale un domaine de liaison aux carbohydrates (CBM) qui permet à l'AMPK de se lier à la surface des particules de glycogène. Cependant, le rôle physiologique de cette liaison reste à ce jour assez incompris (Hudson et al., 2003). Toutefois, des troncations réalisées dans cette séquence ont permis de montrer que celle-ci n'est pas nécessaire à la formation du complexe avec les sous-unités α et γ. Enfin, la partie N-terminale de la sous-unité β présente dans les 65 premiers acides aminés un site de myristoylation qui joue un rôle important dans la régulation de l'activité et de la localisation subcellulaire de l'AMPK. Le rôle de ce site sera détaillé dans le paragraphe 3.2.2.

Quant à la sous-unité γ, celle-ci est constituée dans sa partie amino-terminale d'un site de liaison pour la sous-unité β et dans sa région carboxy-terminale de deux domaines Bateman. Ces domaines correspondent à une répétition en tandem de quatre motifs répétés composés d'environ 60 acides aminés et nommés CBS1 à CBS4 (cystathionine-β-synthase) (Bateman et al., 1997). Chaque motif possède des sites de liaison pouvant théoriquement lier une molécule d'adénosine nucléotide sous la forme d'AMP, d'ADP et d'ATP ce qui permet ainsi à l'AMPK de détecter les changements des niveaux énergétiques de la cellule. Toutefois, il a été démontré que chez les mammifères, le site 2 est en permanence inoccupé même en présence de très forte concentration d'AMP ou d'ATP alors que le site 4 possède une très forte affinité pour l'AMP le rendant de ce fait constamment occupé par cette forme d'adénosine nucléotide (Xiao et al., 2007). Contrairement aux deux sites précédents, les sites 1 et 3 de la sous-unité γ sont capables de lier de manière compétitive l'AMP, l'ADP et l'ATP conférant ainsi à l'AMPK son rôle de senseur énergétique cellulaire. Les régions faisant suite à la partie N- terminale des trois isoformes de la sous-unité γ diffèrent beaucoup en terme de taille, c'est pourquoi leurs séquences ne présentent que 30 % de similarités contrairement à celles des isoformes de la sous- unité α et β qui possèdent respectivement 74 % et 71 % de similitudes (uniprot, blast).

Etant donné que l’association des trois sous-unités de l’AMPK est requise pour moduler son activité, et que la sous-unité α possède le domaine kinase nécessaire à son activation, des études ont été réalisées dans le but de générer des mutants de l’AMPK permettant d’induire soit une activation soit une inhibition constante de l’AMPK. Des troncations du domaine α-CTF de la sous-unité α ont de ce fait été effectuées dans le but d’empêcher à la sous-unité α d’être reliée aux sous-unités régulatrices

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et par conséquent d’être régulée par celles-ci. Il a ainsi été constaté que lorsque la troncation de la sous-unité α a lieu en position 312 (AMPKα 1-312) cela provoque une augmentation importante de l’activité de l’AMPK (Crute et al., 1998 ; Crute et al., 1998) la rendant ainsi constitutivement active. Cette forme que nous reverrons plus tard sera dénommée CA-AMPK (constitutively active form of AMPK). En revanche, la réalisation d’un dominant négatif nécessite l’utilisation de la mutagenèse dirigée dans le but de muter le site de phosphorylation thréonine 172 en alanine rendant ainsi l'AMPK non phosphorylable (Crute et al., 1998). Par ailleurs, une autre forme mutée de la sous-unité α est également utilisée afin de rendre l'AMPK catalytiquement inactive. Pour cela, la lysine 45 est mutée en arginine (mutant K45R)(Crute et al., 1998). L’utilisation de ces trois types de constructions a ainsi permis de mettre en évidence certaines fonctions de l’AMPK dans des conditions physiologiques ainsi que dans certaines pathologies que nous reverrons par la suite.