V. Rôle des EPS dans la cohésion des granules
V.3 Stratification biochimique des granules
Comme on l’a vu précédemment, la répartition des microorganismes au sein du granule n’est pas homogène mais varie en fonction de la profondeur et des gradients de concentration en substrats (donneurs et accepteurs d’électrons). Certains travaux suggèrent que cette stratification de populations microbiennes, due à des limitations de transferts de matière au sein des agrégats peut être couplée à une stratification de la composition de la matrice d’EPS. Les EPS du cœur du granule peuvent en effet être plus impliquées dans la résistance aux phénomènes de rupture de l’agrégat alors que celles situées en périphérie auront d’avantage un rôle dans la résistance au détachement de surface. De plus, les compositions variables en polymères de la matrice des granules peuvent, à leur tour, influer sur les transferts de matière et donc sur les croissances différentielles des microorganismes colonisant les agrégats.
Dans la littérature, on trouve quelques articles étudiant la localisation de différents types d’EPS par marquage spécifique par des molécules fluorescentes. Ainsi, en 2008, Adav et Lee observent au microscope confocal des granules alimentés par de l’eau usée synthétique présentant un rapport C/N de 1,4 et marqués par différentes molécules.
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Figure 40 : Image d’un granule marqué observé au microscope confocale à balayage laser (CLSM). (A) jaune : lipide (rouge de nil) ; (B) vert : protéine (FITC) ; (C) rouge : acides nucléiques (SYTO 63) ; (D) bleu clair : α-polysaccharides (concanavaline A); (E) rose : cellules mortes (SYTO bleu); (F) bleu foncé : β-polysaccharides (blanc de calcofluor). Adav et Lee. (2008). La ligne blache sur l’image A correspond au diamètre le long duquel les auteurs de l’article mesurent les intensités des différents marquages.
Suite à ces marquages, on peut voir que les polysaccharides sont majoritairement concentrés dans les parties les plus externes de l’agrégat (figure 40). On observe une présence beaucoup plus équitablement répartie des protéines et des lipides dans l’ensemble de la structure. Lors de cette expérience, le blanc de calcofluor est utilisé comme marqueur spécifique des β-polysaccharides (bleu foncé) car il forme des ponts hydrogènes avec les liaisons β 1-4 et β 1-3 des glucanes. Il marque la quasi-totalité du granule, ce qui est étrange lorsqu’on compare son marquage à celui de la concanavaline A (en bleu clair). En effet, cette lectine marquant l’ensemble des résidus glucose, elle devrait également marquer tous les β glucanes qui s’associent au calcofluor. Ces divergences de marquage des polysaccharides au cœur des granules peuvent s’expliquer soit par une spécificité de la concanavaline A pour les α-glucanes qui ne reconnaitrait alors pas les β-glucanes, soit par un marquage anarchique et non spécifique de l’ensemble du granule par le blanc de calcofluor.
Outre des spécificités de reconnaissance parfois mal connues, des problèmes liés à la diffusion de ces marqueurs fluorescents de taille relativement importante peuvent fausser les observations. En effet, selon Tsai et al. (2008), les résultats obtenus sur des granules entiers marqués au SYTO 63 ne peuvent pas être pris en compte car ce marqueur pose des problèmes de diffusion dans les granules et ne colore pas à des profondeurs supérieures à 60 µm.
Les données de Adav et Lee (2008) sont confirmées partiellement par McSwain et al. (2005) qui analysent la distribution des protéines et polysaccharides au sein de granules alimentés par du milieu synthétique avec un rapport C/N de 10,7 et préalablement coupés au cryomicrotome avant dépôt des sondes fluorescentes. Ces auteurs trouvent également une répartition des protéines (marquées par du FITC) dans l’ensemble du granule avec toutefois quelques hétérogéneités de distribution (figure 41). En ce qui concerne les polysaccharides, ces auteurs confirment la localisation externe des α- polysaccharides (marqués par de la concanavaline A) déjà établie par Adav et Lee (2008).
Lipides Protéines ADN Polysaccharides Cellules mortes Glucanes liés en β 1-4 et β 1-3
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Figure 41 : Fluorescence relative de chaque épaisseur d’une cryosection de 20 µm d’un granule. La surface du granule est identifiée par une ligne verticale. Les protéines sont marquées au FITC (A) et les résidus mannose ou glucose des polysaccharides à la concanavaline A (B) McSwain et al. (2005).
En outre, en plus de cette stratification, il est possible que la matrice d’EPS des granules présente d’autres hétérogénéités. Il est possible en effet que les caractéristiques de cette matrice changent aux abords des microcolonies de bactéries, et également d’une microcolonie à l’autre si les espèces microbiennes diffèrent. C’est ce qu’ont observé Lemaire et al. (2008b) dans le cas de leurs granules aérobies alimentés par des eaux résiduaires synthétiques dotées d’une DCO de 350 mg.L-1
(acétate), et d’une concentration en ammonium de 35 mg.L-1
et de phosphate 23 mg.L-1. Ces microcolonies ont été étudiées plus précisément, dans le cas des biofilms, par Lawrence et al. en 2007 qui les observent au microscope confocal après marquage de différents types de polysaccharides par des lectines. Lors de cette étude, les auteurs observent un enrobage complexe des polymères autour des bactéries composé de différents types de polysaccharides (figure 42).
Figure 42 : Observation en microscopie confocal d’une microcolonie bactérienne de biofilm (Lawrence et al., 2007). En rouge, marquage des glycoprotéines par la lectine Cicer Ariatinum conjuguée à du Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate (TRITC), en bleu, marquage du fucose par la lectine tetragonolobus purpureas conjuguée à de la cyanine 5, et en vert, marquage des oligomères de N-Acétylegalactosamines par la lectine solanum tuberosum conjuguée à du FITC.
Enfin, en réalisant des mesures de tonométrie (mesure des déformations consécutives à une contrainte) en différents points d’un biofilm de Proteus mirabilis, Lahaye et al. (2007) mettent en évidence des hétérogénéités de propriétés viscoélastiques au sein de ces microcolonies, entre le centre et la périphérie des micro-colonies, le centre apparaissant moins élastique que le bord.
Au sein des agrégats bactériens comme les granules, ils existent donc de grandes hétérogénéités dans la répartition des différents types d’EPS. Ces hétérogénéités, étroitement liées aux activités métaboliques des microorganismes des agrégats, vont bien sûr avoir une influence sur les propriétés physiques des granules à l’échelle locale comme à l’échelle globale.