Conclusion de l’étude bibliographique

Cette étude bibliographique nous a tout d’abord permis de mieux comprendre comment les populations bactériennes des granules aérobies permettaient l’établissement des activités épuratrices nécessaires au retraitements des eaux usées. En particulier, nous avons vu que la densité caractéristiques de ces agrégats, en induisant des limitations de transferts de nutriments et d’oxygène au travers de la matrices d’EPS des granules, permettait le développement d’espèces bactériennes variées aux métabolismes complémentaires.

Cependant, ces propriétés microbiologiques complexes et ces particularités physiques spécifiques aux granules vont également rendre plus difficiles la caractérisation des propriétés physico-chimiques des substances polymériques de la matrice d’EPS des agrégats de type granulaires. En effet, nous avons vu au cours de cette étude que les nombreuses approches qui ont été initiées pour caractériser les physiquement et chimiquement les substances polymériques de la matrice se heurtaient souvent à la grande diversité des molécules de cette matrice, et également à la grande densité des agrégats granulaires qui est souvent un obstacle pour les méthodes d’analyse. En particulier, ces recherches ont mené au développement de différentes techniques d’extraction des EPS. Nous avons vu ainsi que les protocoles d’extraction utilisés pouvaient être répartis en deux catégories : les méthodes douces qui ne posent pas de problème de lyse cellulaire mais ne permettent pas la récupération de grandes quantités d’EPS, et des méthodes dures dont le rendement est beaucoup plus élevé mais qui présentent un grand risque de contamination par du contenu bactérien (table 1). La combinaison de méthodes est une solution pour augmenter les rendements d’extraction au delà de 500 mg.g-1

mais attention à contrôler la lyse. Afin d’optimiser au mieux une stratégie d’extraction, il faudra donc faire un compromis entre l’efficacité de la méthode et la préservation de l’intégrité cellulaire.

Ces extractions permettent ensuite d’analyser la composition de la matrice d’EPS. Celle ci est essentiellement composée de protéines et de polysaccharides mais avec une disparité importante des rapports PN/PS qui varient entre 1 et 8 selon les études. Ces variations sont liées aux diverses méthodes d’extraction, aux techniques de dosage et à la lyse cellulaire qui augmente le rapport par relargage des composés intracellulaires essentiellement protéiques. Elle peuvent également provenir de la diversité des conditions de culture des agrégats qui vont influencer la nature des populations bactériennes présentes dans les granules et ainsi induire des différences dans la composition des EPS de la matrice.

En ce qui concerne la caractérisation à l’échelle moléculaire des polymères extraits, quelques travaux ont été réalisés par analyse en chromatographie liquide. Ainsi, des empreintes de tailles ont été obtenues par chromatographie d’exclusion stérique sur des boues granulaires anaérobies prélevées sur sites industriels (Simon et al.2009). Les spectres infra rouge réalisés sur les extraits provenant des mêmes installations ont confirmé la présence de fonctions chimiques spécifiques des protéines et polysaccharides mais ont aussi révélé la présence substances humiques et d’acides uroniques (D’Abzac et al., 2010a et b). Cependant, la grande diversité des EPS qui composent ces extraits rend difficile les interprétations des analyses moléculaires et les données obtenues permettent d’obtenir seulement des informations globales sur la composition en EPS de la matrice.

Il pourrait donc être intéressant de fractionner les EPS avant de les étudier. C’est la stratégie adoptée par Seviour et al. (2009b) qui séparent les polysaccharides des autres composants des EPS grâce à un protocole d’enrichissement par précipitation acide. Cela leur permet d’analyser séparément le pouvoir gélifiant de cette fraction polysaccharidique et d’en déduire ainsi leur rôle dans la cohésion des granules. Toutefois, cette activité de gélification est analysée pour des concentrations importantes, probablement très supérieures à celles existant in situ.

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Des études ont également été menées en soumettant les granules à des incubations dans différents agents chimiques ou en présence d’enzymes. Les traitements par les enzymes incluent essentiellement des activités de type protéase ou glycosidase. La digestion spécifique de protéines ou polysaccharides susceptibles d’établir des interactions intermoléculaires devrait alors permettre de mieux définir leur distribution spatiale ainsi que leur contribution à la structure des granules. De cette manière, Seviour et al. (2009a) mettent en évidence le rôle prépondérant des α (1-4) glucanes en mesurant sur leur granules une baisse significative du paramètre d’élasticité suite à la digestion par une α-amylase. De même, Adav et Lee. (2008) parviennent à provoquer une désintégration complète de leurs agrégats granulaires après digestion par une β-amylase. Ils en concluent que les β-polysaccharides sont une source importante de cohésion, mais cette déduction est due à une erreur dans la spécificité de l’enzyme. En effet, les β-amylases ne digèrent pas les β-polysaccharides, comme le supposent Adav et Lee. (2008), mais détruisent les liaisons α (1-4) glucanes des α-polysaccharides. La distinction entre α et β-amylases ne provient en fait pas de la spécificité pour le substrat, mais du mécanisme enzymatique, les β-amylases ayant une activité exogène (digestion de la liaison osidique à partir de l’extrémité réductrice de la chaine de glucoses liés en  1-4) alors que les α-amylases ont une activité endogène (digestion au hasard à l’intérieur la chaine de glucose liés en  1-4). Par conséquent, les résultats de Adav et Lee. (2008) sont en accord avec ceux de Seviour et al. (2009a) dans la mesure où ils confirment l’importance des α (1-4) glucanes. Cependant, sachant que les α et β-amylases sont spécifiques des mêmes substrats, il est étrange que dans l’étude de Adav et Lee. (2008), l’utilisation d’une β-amylase entraine une déstructuration importante alors que l’utilisation d’une α-amylase n’affecte pas l’intégrité du granule. Inversement, dans l’étude de Seviour et al. (2009a), la cohésion du granule est diminuée après digestion par l’α-amylase alors qu’elle n’est pas affectée après digestion par la β-amylase.

Seviour et al. (2009a), déduisent également de digestions par une protéase qui abaisse le paramètre d’élasticité mesuré sur leurs granules, que les protéines ont également un rôle important dans les agrégats granulaires vis-à-vis de la cohésion. Ce rôle présumé des protéines est en accord avec les résultats de Zhang et al. (2007) qui remarquent que la densification des granules s’accompagne d’une augmentation de la proportion des protéines dans les EPS. Il est également logique de penser que les protéines vont jouer un rôle important dans la matrice d’EPS des granules puisque la majorité des études réalisées indiquent que ces polymères en sont le composé majoritaire. C’est en particulier le cas lors de l’étude de Zhang et al. (2007) qui montrent un rapport PN/PS de 4,9 et de l’étude de McSwain et al. (2005), pour qui le rapport PN/PS oscille entre 6 et 8. De plus, comme le montrent quelques autres études, l’observation microscopique de granules aérobies cultivés dans différentes conditions a permis de visualiser la répartition non homogène des EPS dans les agrégats avec un cœur majoritairement protéique dans une enveloppe composée de polysaccharides et de protéines (Adav et Lee, 2008 ; McSwain 2005). Cette répartition particulière, est à mettre en lien avec la stratification des microorganismes.

Deux types de polymères, les protéines et les alpha-glucanes, semblent donc être davantage impliqués dans la structuration et la cohésion du granule. D’autres expérimentations sont maintenant nécessaires pour savoir quels sont les motifs ou groupements chimiques portés par ces molécules susceptibles d’établir des liaisons inter ou intra molécules au sein de la matrice.

Une piste de recherche prometteuse concerne l’implication de groupements anioniques et l’existence de liaisons de type ponts ioniques médiés grâce à la présence de cations divalents. Même si sur ce point, aucune étude n’a été réalisée sur des agrégats denses comme les granules, certains travaux viennent quant à eux montrer l’importance des cations divalents comme le calcium dans la matrice d’EPS pour la cohésion de flocs. Sobeck and Higgins (2002) ont ajouté des ions Mg2+

et Ca2+ jusqu’à des concentrations de 15 méq.L-1 à des boues activées ce qui a provoqué l’épaississement d’un facteur cinq par bio-floculation des boues activées alors que, à l’inverse, la présence de Na+, dans les mêmes proportions, a entraîné une défloculation des boues.

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Ce phénomène peut s’expliquer par un pontage par cations divalents entre polymères anioniques qui stabiliserait la structure de la matrice d’EPS. Ce pontage peut avoir lieu entre des protéines possédants des acides aminés chargés négativement (acides glutamiques et aspartiques, table), ou entre polysaccharides contenant des oses anioniques (alginates ou carraghénanes par exemple). En particulier, la capacité de l’alginate à former des gels résistants en présence de calcium est décrite par Sobeck et Higgins en 2002. Sheng et al. (2006) confirment ces résultats en montrant que la sensibilité des flocs augmente lorsqu’ils sont mis en contact avec de l’EDTA, un chélateur de cation divalents. Dans le cas de granules anaérobies utilisés pour le retraitement d’eaux usées dans des installations industrielles étudiés par D’abzac et al. (2010a et b), on observe aussi une grande sensibilité à l’EDTA. En effet, on remarque dans ces études que l’utilisation d’une incubation dans de l’EDTA 2 % pendant 3h pour l’extraction d’EPS est très efficace. Selon les résultats obtenus, ce traitement permet d’augmenter les quantités extraites de 155 % par rapport au procédé classique utilisant la CER.

La description des matrices des granules comme des gels composés d’EPS permet de mieux comprendre le lien entre les caractéristiques chimiques des EPS à l’échelle microscopique, et les propriétés physiques des granules à l’échelle macroscopique. L’étude des gels montre en effet comment les différents polymères peuvent interagir entre eux et s’associer pour former un matériau cohésif dont les propriétés sont proches de celles de la matrice d’EPS des granules. Dans ce cadre, ces études nous permettent également de comprendre quels sont les facteurs importants pour obtenir une structure cohésive. D’après les résultats des expériences réalisées par Shimada et Matsushita (1980) avec 4 types de protéines présentant des caractéristiques physico-chimiques très différentes (taille, point isoélectrique, solubilité dans l’eau, structures tertiaire et quaternaire), on peut conclure que toutes les protéines peuvent former des gels. Même l’albumine de sérum qui fait partie de la famille des globines très hydrophiles peut coaguler à des concentrations de 0,1 % soit 1 g/L. Cependant, les propriétés chimiques des polypeptides vont avoir un impact élevé sur la cohésion de ces gels. Il semble, en particulier, que le taux d’hydrophobicité soit un facteur favorable, ainsi que l’absence de charge globale positive ou négative des polymères. Des protéines dénaturées et des conditions de pH proches de leur point isoélectrique auront ainsi plus tendance à former des gels résistants.

Dans le cas des polysaccharides, les réseaux sont souvent organisés (double hélice pour les carraghénanes, boite à œufs de l’alginate) et la capacité à former des gels est accrue si les oses sont chargés (acides uroniques des alginates ou de la pectine, sulfates des carraghénanes). La description des modèles de gels protéiques et/ou polysaccharidiques ont ainsi permis de mieux comprendre l’influence de l’environnement chimique des granules (pH, température, force ionique et présence de certains cations comme notamment le calcium),sur les mécanismes chimiques à l’origine de la cohésion des agrégats.