Analyse des propriétés chimiques des EPS

IV.2.1. Utilisation de méthodes chromatographiques

La chromatographie est une technique physique de séparation d'espèces chimiques. L'échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par une phase mobile le long d'une phase stationnaire contenue dans une colonne. Chaque espèce moléculaire se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases. Cette technique d'analyse chimique est couplée à un détecteur qui permet de déterminer les durées d’élution de chacune des espèces chimiques analysée ainsi que et de les quantifier. En fonction de la nature des deux phases, on peut donc distinguer plusieurs types de chromatographie. Parmi celles-ci, on peut citer, la chromatographie d’exclusion stérique qui permet de séparer les molécules selon leur volume hydrolique que l’on extrapole à la taille, la chromatographie d’échange d’ions qui sépare les molécules selon leurs charges, et la chromatographie d’interactions hydrophobes qui sépare les molécules en fonctions de leur caractère hydrophobe.

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En 2009, Simon et al. ont cherché à évaluer l’intérêt de l’utilisation de la chromatographie d’exclusion stérique pour l’analyse des EPS de boues granulaires anaérobies alimentées par des eaux résiduaires naturelles. Cette expérience est réalisée en utilisant deux colonnes de filtration branchées en série : une première colonne séparant les molécules entre 0,1 et 7 kDa et une seconde séparant les molécules entre 10 et 600 kDa. Cette étude a permis de comparer les diversités de tailles des EPS provenant 3 boues granulaires avec celle d’une boue floculante. Ils démontrent ainsi que chaque agrégat bactérien possède une empreinte chromatographique qui lui est spécifique, et que leur contenu en EPS varie avec les conditions de culture imposées. Ils mettent également en évidence un certain nombre de problèmes liés à l’utilisation de la chromatographie d’exclusion stérique. En particulier, l’établissement d’interactions ioniques ou hydrophobes (en fonction de la nature de la phase mobile) entre les EPS et la phase stationnaire peut augmenter les temps de rétention dans la colonne et fausser les mesures de tailles des EPS.

En utilisant un tampon Hepes 75 mM additionné de 15 % d’acétonytrile (v/v) lors des analyses par exclusion stérique d’EPS de différentes boues flocculantes et granulaires, Villain et al (2010) parviennent à limiter fortement ces effets,

Selon l’étude de Bourven et al. (2011) effectuée sur des EPS de flocs de boues activées, des agents utilisés pour l’extraction des EPS peuvent également perturber les analyses. Ainsi, dans cette étude, les auteurs constatent que de l’EDTA résiduaire restant dans les échantillons absorbe les rayonnements ultraviolet à 280 et 210 nm et perturbe les chromatogrammes d’exclusion stérique. Pour remédier à cela, ils ont recours à une autre méthode de détection et quantifient les protéines par leur fluorescence (excitation à 221 nm, et émission à 360nm).

Les méthodes de chromatographie apparaissent comme des outils intéressants pour la caractérisation globale des EPS d’agrégats bactériens car elles permettent d’obtenir des empreintes différentes en fonction de l’origine des EPS. Cependant, il faut être prudent lors de l’interprétation des chromatogrammes. En particulier, dans le cas de la filtration sur gel, la complexité des échantillons et la résolution insuffisante des méthodes peut engendrer des difficultés pour les analyses quantitatives.

IV.2.2. Utilisation de la spectrophotométrie infrarouge

Le recours à la spectrophotométrie infrarouge peut également permettre l’analyse des EPS. Cette technique est basée sur l’absorption de radiations infrarouge par la molécule. Les longueurs d’onde absorbées vont de 2,5 à 25 µm. Les énergies mises en jeu sont principalement des énergies de vibration et de rotation. L’analyse s’effectue par un balayage des longueurs d’onde avec l’obtention d’un spectre infrarouge présentant des bandes d'absorption. Les longueurs d’onde d’absorption des atomes dépendent de leur entourage électronique. Par conséquent, on pourra retrouver sur le spectre, des pics correspondant aux fonctions chimiques présentes dans les molécules. Une table regroupant les longueurs d’onde mesurées des fonctions chimiques permettra alors d’identifier les groupements présents dans les échantillons analysés. La table 2, est celle utilisée dans l’étude de Comte et al. (2006). Toutefois, l'analyse d’un spectre est parfois très difficile car une même liaison peut avoir différents modes de vibration et faire apparaitre plusieurs bandes d'absorption.

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Table 2 : Plages de longueurs d’ondes d’infra rouges absorbées par les principaux groupements chimiques fonctionnels des EPS selon Comte et al. (2006).

En 2006, Comte et al. utilisent cette technique pour faire l’inventaire des fonctions chimiques présentes dans des EPS extraites de flocs de boues activées. Cela leur permet en particulier de détecter dans leurs extraits la présence de protéines et de polysaccharides.

Cette technique est également utilisée par D’Abzac et al. (2010a et b) pour l’analyse d’EPS de quatre types de boues granulaires anaérobies extraites par neuf protocoles d’extraction distincts. Là encore, les spectres obtenus permettent de connaitre le contenu des échantillons d’EPS. Chacune des solutions analysées contient des protéines, des polysaccharides, mais aussi des substances humiques, des acides nucléiques et des lipides. Les spectres obtenus révèlent également la présence de résidus des espèces chimiques utilisées pour les étapes d’extraction (notamment de l’EDTA, du formaldéhyde ou de l’éthanol, selon les méthodes employées).

La spectrophotométrie infrarouge permet donc d’obtenir un certain nombre d’informations sur le contenu des EPS extraites des granules. Cependant, comme dans le cas du recours à des méthodes de chromatographie, la complexité du contenu des échantillons rend les interprétations difficiles. L’observation des spectres ne permet en effet pas de caractériser avec précision les polymères et de distinguer notamment différentes espèces de polysaccharides ou de protéines. En outre, le chevauchement des pics, observé systématiquement dans ces mesures, empêche les quantifications des espèces chimiques détectées.