V. Rôle des EPS dans la cohésion des granules
VI.2. Objectifs de la thèse
L’objectif de notre étude est de comprendre comment les EPS de biomasses granulaires, de par leurs natures et leurs propriétés chimiques permettent de structurer les agrégats denses et d’assurer leur cohésion.
Le problème qui se pose dans l’étude des EPS des granules est avant tout leur diversité et leur complexité. De plus, la distribution quantitative et qualitative des EPS est influencée par les conditions environnementales qui conditionnent l’écologie microbienne et les propriétés chimiques des molécules (charge, hydrophobicité).
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Afin de pouvoir étudier ces polymères, deux approches peuvent être envisagées : une extraction des EPS permettant l’analyse in vitro des caractéristiques biochimiques et physico-chimiques de ces molécules ou une étude in situ après marquage et observation microscopique des EPS présents au sein du granule. Nous proposons de mener les deux stratégies en parallèle au cours de la thèse. En effet, la stratégie par extraction permettra d’obtenir des éléments quantitatifs après dosage des EPS extraits et de pouvoir les fractionner avant d’analyser leurs propriétés par des techniques de chromatographie. L’analyse de la distribution de ces EPS au sein du granule permettra quand à elle d’appréhender l’impact du micro-environnement local et le lien possible entre stratification biochimique et stratification microbienne.
En ce qui concerne l’approche in vitro, nous avons vu que l’extraction des EPS est souvent problématique soit parce que son rendement est faible, soit parce qu’elle provoque la libération de composés intracellulaires qui viennent contaminer les échantillons. Des stratégies ciblant spécifiquement plusieurs types d’interactions ont été envisagées afin d’augmenter les quantités d’EPS extraites mais aussi la diversité des EPS agrégés dans la matrice. C’est la stratégie qu’emploient Ras et al. en appliquant successivement à des flocs (2008a) ou à des biofilms (2011), une étape de déstructuration mécanique suivie d’une étape d’extraction ciblant préférentiellement des composés hydrophobes et enfin une étape d’extraction ciblant les composés ioniques.
La première étape de cette étude consistera à appliquer cette stratégie d’extraction multi-méthodes au cas des granules. Compte-tenu des propriétés physiques de ces agrégats denses, nous travaillerons à la mise au point d’un procédé d’extraction combinant des méthodes physiques et des méthodes chimiques relativement douces pour éviter la lyse mais surtout permettre d’extraire des EPS présentant des propriétés chimiques variées. Ainsi, des EPS faiblement liées pourraient être extraites lors des étapes de fragilisation mécanique alors que les EPS liées par des interactions hydrophobes et ioniques seraient libérés après action plus ou moins spécifique de détergents et de chélateurs de cations. Beaucoup de travaux décrivent en effet le rôle du calcium comme agent pontant d’EPS anioniques et il parait donc judicieux d’utiliser un chélateur de cations divalents. En ce qui concerne le caractère hydrophobe, c’est généralement l’hydrophobicité de surface des cellules qui est analysée et aucune étude n’a pu mettre en évidence la présence d’EPS hydrophobes au sein des granules. Nous proposons d’utiliser un détergent non ionique pour favoriser l’extraction des EPS hydrophobes s’ils sont présents dans la matrice et enrichir leur représentativité lors d’une étape d’extraction spécifique.
Dans un second temps, nous chercherons à caractériser les molécules extraites des granules. Leur nature biochimique (protéines, sucres) mais aussi les propriétés physico-chimiques des EPS extraites sera analysée (taille, charge, hydrophobicité). Le fractionnement des EPS déjà initié par chaque étape du protocole d’extraction multi-méthode sera pour cela poursuivi par des techniques plus résolutives de chromatographie liquide. A ce stade, nous effectuerons l’analyse différentielle des propriétés chimiques des EPS extraites de flocs peu denses avec celles des EPS extraites de granules. En effet, parmi les différents types d’EPS et déterminants chimiques que nous aurons caractérisés, nous chercherons à identifier ceux qui sont spécifiques de la structure granulaire afin de les étudier en priorité.
Au cours de la dernière phase du travail, nous chercherons à savoir si les EPS mis en évidence lors des étapes d’extraction et de fractionnement peuvent jouer un rôle clef dans l’agrégation, et nous essayerons de comprendre comment ils remplissent ce rôle. A ce stade de l’étude, l’approche in situ permettra de visualiser la structure des granules avant et après des traitements spécifiques visant à altérer un type moléculaire ou un caractère chimique.
Outre l’analyse des images prises au microscope, il conviendra de quantifier l’impact de ces traitements sur la cohésion des granules. Pour cela, l’utilisation de contraintes de cisaillement contrôlées, générées par une enceinte agitée pourrait être couplée à la caractérisation biochimique des EPS relarguées ainsi qu’à leur observation par microscopie.
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Un travail similaire a déjà été réalisé par d’autres équipes lors de l’étude des propriétés cohésives et de la résistance des granules après digestion des EPS par action enzymatique (Seviour et al., 2009a). Cependant, seules des enzymes présentant des activités polysaccharidiques peu diversifiées (uniquement α et β – amylases) ont été utilisées et nous proposons d’élargir les cibles moléculaires à d’autres polysaccharides et notamment à ceux présentant un caractère anionique (sucres uroniques). Ces résultats pourront être reliés aux conditions de culture et de formation des granules au niveau du réacteur afin d’améliorer la stabilité des boues granulaires à travers la gestion de certains paramètres environnementaux tels que le pH, la force ionique, l’alimentation en carbone et en azote et éventuellement l’utilisation d’additifs.