Quantification des EPS

V.2.1. Dosage des protéines par la méthode à l’acide bicinchonique (BCA)

Selon Smith et al. (1985), la quantification des protéines par la méthode BCA implique la formation d’un complexe BCA-Cu2+

de couleur pourpre dont l’intensité est mesurée à 562 nm.

Le réactif BCA est un kit commercialisé par SIGMA (BCA-Kit), constitué de deux solutions :

- un composant A contenant de l’acide bicinchonique, du carbonate de sodium, du bicarbonate de sodium, du tartrate de sodium et du sulfate cuprique pentahydraté ;

- un composant B contenant du sulfate de cuivre à 1%.

La solution de travail BCA se prépare en mélangeant les composants A et B dans des proportions 50/1 (v/v). Dans le cas du micro-dosage, 25 µL d’échantillon sont incubés avec 200 µL de solution de travail BCA dans des micro-plaques de 96 puits. Dans le cas du macro-dosage, utilisé pour des échantillons fortement chargés en EDTA, 25 µL d’échantillon sont incubés avec 1 mL de solution de travail BCA. L’incubation est effectuée pendant 15 minutes à 60 °C, la plaque est ensuite refroidie à température ambiante avant la lecture à 562 nm en lecteur à microplaque (FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH) pour la microméthode ou par spectrophotométrie (UV SPECTRONIK 1201) en micro- cuve pour la macrométhode.

Une gamme étalon en Bovine Serum Albumine (BSA, SIGMA) à des concentrations comprises entre 0 et 1 g.L-1 est traitée en parallèle de manière identique.

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V.2.2. Dosage des polysaccharides par la méthode à l’Anthrone

Selon Dreywood (1946), le dosage à l’Anthrone permet de mesurer les sucres totaux réducteurs qui possèdent des fonctions carbonyles (C = O). La réaction entre l’anthrone et les sucres est visualisée par une couleur verte dont l’intensité est mesurée à 620 nm.

Le réactif à l’Anthrone (SIGMA) est préparé à raison de 2 g.L-1

dans de l’acide sulfurique concentré (ACROS organics). 100 µL d’échantillon sont mis en contact avec 200 µL de réactif Anthrone dans chaque puits d’une plaque 96 puits. Les plaques sont laissées à incuber 30 min à 70 °C puis refroidies à 4°C jusqu’à la température ambiante. L’absorbance est lue à 620 nm en lecteur de plaque (FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH).

Des solutions de D-glucose (SIGMA) à des concentrations comprises entre 0 et 0,15 g.L-1 sont utilisées comme étalons.

V.2.3. Dosage des acides uroniques par la méthode au MétaHydroxyDiPhénol (MHDP)

V.2.3.1. Principe du Dosage :

Selon van den Hoogen et al (1998), le dosage au MétaHydroxyDiPhénol (MHDP) est spécifique des acides uroniques qui sont des sucres chargés dans lesquels, une fonction acide carboxylique -COOH remplace l'alcool primaire -CH2OH des oses neutres (fonction située en position 6 dans le cas du

glucose qui devient alors acide glucuronique). La réaction entre le MHDP et les sucres chargés est visualisée par une couleur rose dont l’intensité est mesurée à 540 nm.

Deux solutions de réactifs sont préparées pour ce dosage. La première est une solution de tétraborate de sodium 120 mM (SIGMA) dans de l’acide sulfurique 96 % (ACROS organics). La seconde est obtenue par ajout d’un volume de solution de MHDP 100 mg.mL-1

dans le dimethyl sulfoxide (DMSO) dans 50 volumes d’acide sulfurique 80 % (ACROS organics).

Lors d’une première étape, 40 µL d’échantillons répartis dans une microplaque 96 puits sont mis en présence de 200 µL de la première solution, ce qui donne une concentration finale en acide sulfurique de 80 % (v/v) et en tétraborate de sodium de 0,1 M. La plaque est ensuite placée 1 h à 80 °C. L’acide sulfurique permet l’hydrolyse des polymères. La présence du tétraborate quant à elle améliore la sensibilité du dosage (van den Hoogen et al (1998)).

La densité optique à 540 nm est ensuite prise à l’aide d’un lecteur de plaque (FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH). Cette première absorbance a pour but de mesurer le bruit de fond du à des colorations aspécifiques (principalement des oses neutres qui se colorent en marron au contact de l’acide sulfurique concentré).

Puis 40 µL de la seconde solution sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est laissée 15 min à température ambiante et la densité optique est à nouveau mesurée en lecteur de plaque (FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH). L’intensité de la mesure correspondant à chaque échantillon est obtenue en soustrayant le bruit de fond à cette seconde valeur.

Des solutions d’acide D-glucuronique (SIGMA) à des concentrations comprises entre 0 et 0,25 g.L-1

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V.2.3.2. Validation du dosage

Ce dosage utilisant le MHDP qui est utilisé dans le cadre de cette étude a rarement été utilisé dans des milieux complexes tels que les extraits d’EPS issus de granules aérobies. C’est pourquoi il est important de mesurer les interférences entre ce dosage et les différents composants potentiels des extraits (oses neutres, protéines).

Les signaux respectifs attribués aux différents types d’acides uroniques devront être comparés afin de savoir si ce dosage permet bien la quantification de l’ensemble des acides uroniques de façon équivalente.

V.2.3.2.1. Interférences avec les protéines

Il est possible que la présence de protéines en concentration importante soit à l’origine de perturbation de la mesure. En particulier si celles ci sont glycosylées. L’influence de concentrations croissantes en protéines a donc été mesurée via l’ajout de différentes protéines aux solutions standards d’acide glucuronique. Le test est effectué avec des protéines glycosylées (Albumine de Sérum de Bœuf (BSA) et α-amylase) et non glycosylées (trypsine) pour des concentrations de 0,05 ; 0,125 ; 0,25 et 0,5 g.L-1. Les résultats obtenus montrent que ces concentrations en protéines mélangées à la gamme d’acide glucuronique ne modifient pas le signal obtenu pour le dosage de l’acide glucuronique. Cela signifie que les protéines présentes dans les extraits d’EPS ne devraient pas gêner le dosage des acides uroniques.

V.2.3.2.2. Effets de variations des proportions de réactif du dosage Des gammes étalons d’acide glucuronique ont été dosées en faisant varier les quantités de solution de travail (solution de tétraborate de sodium dans l’acide sulfurique concentré) et de solution de réactif MHDP (figure 50). L’objectif est de tenter d’augmenter la sensibilité de ce test dont les résultats varient d’un échantillon à l’autre pour des concentrations égales en acide glucuronique.

Solution de travil I + 100 µL : y = 2,7064x + 0,0122 R2 = 0,921 Solution de MHDP -20 µL : y = 1,518x + 0,0298 R2 = 0,9166 Solution de MHDP +40 µL : y = 2,0602x + 0,0356 R2 = 0,9101 Standard : y = 2,0556x + 0,0395 R2 = 0,8852 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 [A Glucuronique] g/L D O ( 5 4 0 n m )

Figure 50 : dosage de gammes d’acide glucuronique en utilisant différentes proportions de la solution de travail 1 (tétraborate de sodium 120 mM dans de l’acide sulfurique à 96 %) et de solution de MHDP (MHDP 2 mg.mL-1

, DMSO 2 % (V/V), acide sulfurique 78,4 %).

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Ces variations dans la composition des réactifs de dosage n’engendrent pas de différences sur l’intensité du signal ni sur sa précision. Il est donc inutile de modifier le protocole de dosage. En outre, d’après van den Hoogen et al, (1998), les proportions de réactifs utilisés ont été choisies car elles permettaient de maintenir constante la concentration en acide sulfurique au cours de l’expérience et donc de ne pas provoquer de variations dans le phénomène de brunissement dû aux oses neutres. Si le dosage des acides uroniques par la méthode au MHDP semble efficace, il n’est pas à ce stade complètement validé. Il sera notamment nécessaire de réaliser ce test sur des gammes de solution d’alginate de composition complètement maitrisée, ainsi que sur différents autres types d’acides uroniques. Néanmoins, ce dosage sera utilisé dans la détermination de la nature des EPS extraits des granules.