STAT3 se fixe sur le promoteur de Eme1 lorsqu’il est phosphorylé sur la sérine 727 mais pas sur la tyrosine 705

En réponse à une inhibition des topoisomérases I, la kinase Cdk5 interagit et phosphoryle STAT3 sur son résidu sérine 727. Nous avons montré que STAT3 se fixe sur le promoteur de Eme1 afin de réparer les cassures doubles brins. Ces observations suggèrent que STAT3 peut fonctionner comme un régulateur transcriptionnel, à la suite de la phosphorylation de son résidu sérine 727 néanmoins sans phosphorylation sur son résidu tyrosine 705. Pour confirmer cette seconde hypothèse, nous avons réalisé des immunoprécipitations de chromatine des deux formes phosphorylées de STAT3 sur le promoteur de Eme1 (Figure 27). Ces expériences sont réalisées dans deux conditions différentes : soit les cellules HT29 en croissance, sont traitées ou non au sn38 pendant 48h (figure 27, lignes 1-4), soit les cellules sont stimulées ou non pendant 30min avec de l’IL-6 après avoir été privées de sérum durant 24h (figure 27, lignes 5-6).

FIGURE 27| STAT3 est recruté sur le promoteur de Eme1 lorsqu’il est phosphorylé sur son résidu sérine 727. Les cellules HT29 sont traitées ou non avec le sn38 (5ng/mL) pendant 48h. La chromatine soluble est préparée et immunoprécipitée avec des anticorps dirigés contre les formes phosphorylées sur les résidus sérine et tyrosine de STAT3 (lignes 1-4). En parallèle, les cellules sont privées de sérum pendant 24h puis stimulées avec de l’IL-6 pendant 30min. La chromatine est immunoprécipitée dans les mêmes conditions. L’ADN est amplifié en utilisant des amorces couvrant le site de liaison de STAT3 sur le promoteur de Eme1. L’analyse de ChIP est effectuée par PCR quantitative en temps réel en comparant par rapport à une immunoglobuline contrôle et une région contrôle (n=3)

Comme nous l’attendions, nous avons observé dans les cellules en croissance qu’aucune des deux formes phosphorylées de STAT3 n’est présente sur le promoteur de Eme1 (Figure 27, ligne 1 et 3). Néanmoins, après un traitement au sn38, seule la forme phosphorylée sur le résidu sérine 727 est liée au promoteur de Eme1 au niveau du site de liaison de STAT3 (Figure 27, lignes 2 et 4). Lorsque les cellules sont stimulées à l’IL-6, aucune des formes phosphorylées de STAT3 n’est retrouvée sur le promoteur de Eme1. Les mêmes résultats sont obtenus en réalisant une immunoprécipitation de chromatine à partir d’un anticorps dirigé contre la forme totale de STAT3 dans les mêmes conditions. Ces observations suggèrent donc que la forme phosphorylée sur la sérine 727 de STAT3 peut être associé à un gène cible, comme Eme1, sans phosphorylation sur le résidu tyrosine 705. De plus, le promoteur de Eme1 n’est pas une cible du facteur de transcription en réponse à une stimulation de cytokines.

Etant donné que la Cycline D1 et c-Myc sont des gènes cibles connus de STAT3, nous avons alors voulu savoir, de la même manière que Eme1, quelles formes phosphorylées de STAT3 se fixaient sur les promoteurs de ces gènes cibles. Pour cela, nous avons réalisé des immunoprécipitations de chromatine dans les mêmes conditions que la figure 26. La figure 26A est réalisée sur le promoteur de la Cycline D1 tandis que la figure 26B est effectuée sur le promoteur de c-Myc.

Les résultats obtenus sur les promoteurs des gènes de la Cycline D1 et de c-Myc sont totalement différents de ceux obtenus sur le promoteur de Eme1. Dans les cellules HT29 en croissance (Figure 28A et 28B, lignes 1 et 3), STAT3 est phosphorylé sur son résidu tyrosine 705 et est présent sur les promoteurs de ces gènes impliqués dans la prolifération cellulaire. En revanche, lorsque les cellules sont traitées au sn38 (Figure 28A et 28B, lignes 2 et 4), nous n’observons aucune fixation de STAT3 sur ces promoteurs. En parallèle, dans des cellules privées de sérum (Figure 28A et 28B, lignes 5 et 7), STAT3 n’est pas lié aux promoteurs de la Cycline D1 et de c-Myc. Seule une stimulation à l’IL-6 permet la fixation de la forme phosphorylée sur la tyrosine 705 de STAT3 sur ces deux promoteurs (Figure 28A et 28B, lignes 6 et 8).

FIGURE 28| STAT3 est recruté sur les promoteurs de la Cycline D1 et de c-Myc lorsqu’il est phosphorylé sur son résidu tyrosine 705. A et B. Les cellules HT29 sont traitées ou non avec le sn38 (5ng/mL) pendant 48h. La chromatine soluble est préparée et immunoprécipitée avec des anticorps dirigés contre les formes phosphorylées sur les résidus sérine et tyrosine de STAT3 (lignes 1-4). En parallèle, les cellules sont privées de sérum pendant 24h puis stimulées avec de l’IL-6 pendant 30min. La chromatine est immunoprécipitée dans les mêmes conditions. L’ADN est amplifié en utilisant des amorces couvrant le site de liaison de STAT3 sur le promoteur de la Cycline D1 (A) et de c-Myc (B). L’analyse de ChIP est effectuée par PCR quantitative en temps réel en comparant par rapport à une immunoglobuline contrôle et une région contrôle (n=3).

L’ensemble de ces résultats confirment ceux publiés précédemment par notre laboratoire et par d’autres équipes. Ils ont montré que STAT3 peut activer les gènes de la Cycline D1 et de c-Myc à la suite d’une phosphorylation sur son résidu tyrosine 705 effectuées par les kinases JAK. STAT3 peut alors recruter ses cofacteurs tels que CBP et SRC. Cependant, nous ne sommes pas capables de détecter la forme phosphorylée de la sérine 727 sur ces deux promoteurs. En revanche, en réponse à une inhibition des topoisomérases de type I, seule la phosphorylation sur le résidu sérine de STAT3 est détectée sur le promoteur de Eme1.

Nous savons que, pour être transloqué dans le noyau, STAT3 doit former un dimère. En réponse à des cytokines ou des facteurs de croissance, STAT3 est phosphorylé sur son résidu tyrosine entrainant une modification de sa conformation. Dans les cellules en croissance nous n’avons détecté aucune phosphorylation sur le résidu tyrosine 705 par western blot. En revanche, nous avons réussi à observer la phosphotyrosine 705 en utilisant la technique de ChIP sur les gènes

de la cycline D1 et de c-Myc dans des cellules en croissance, mais cette fixation est perdue à la suite d’une inhibition des topoisomérases de type I. En réponse à des dommages de l’ADN, STAT3 est phosphorylé sur son résidu sérine 727 et pourrait alors s’associer avec un partenaire, lui permettant de se transloquer dans le noyau, de lier le promoteur de Eme1 et d’activer sa transcription. Des explications et des hypothèses concernant ces résultats seront émises lors de la discussion.

VI. Conclusion : La kinase Cdk5 régule le facteur de transcription