La kinase Cdk5 régule le facteur de transcription STAT3 pour empêcher les dommages de l’ADN
I. Une inhibition des topoisomérases de type I induit la phosphorylation de STAT3 sur son résidu Sérine 727
Afin de savoir si le facteur de transcription STAT3 est activé en réponse à l’inhibition des topoisomérases de type I, les cellules colorectales HT29 sont traitées au sn38, le métabolite actif de l’Irinotecan, puis les deux phosphorylations sont étudiées par la technique de Western blot. Nous observons que STAT3 est phosphorylé sur son résidu sérine 727 en réponse au sn38 (figure 14A, ligne 3 et 4).
FIGURE 14| STAT3 est phosphorylé sur son résidu sérine 727 à la suite d’une inhibition des topoisomérases de type I. A. Les cellules HT29 sont traitées au sn38 (5ng/mL) pendant les temps indiqués puis les extraits totaux sont analysés par Western blot en utilisant des anticorps dirigés contre les formes phosphorylées sérine 727 et tyrosine 705 de STAT3. Les membranes sont réutilisées pour la forme totale de STAT3 ainsi que pour hsc70, représentant le contrôle de charges (n=3). B. Les cellules HT29 sont traitées au sn38 pendant 48h. A partir des extraits cellulaires totaux, l’expression de p-Erk1/2 et de sa forme totale est analysée par Western blot en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre ces protéines (n=3).
La lignée HT29, utilisée pour notre étude, présente une mutation homozygote sur le codon 273 du gène de p53 conduisant à la substitution de l’acide aminé arginine en histidine et à la modification du domaine de liaison à l’ADN de p53. Du fait de cette mutation, la phosphorylation observée sur la sérine 727 de STAT3 ne semble pas être liée au gène suppresseur de tumeur, p53. Nous avons alors voulu savoir si cette phosphorylation sur le résidu sérine 727 de STAT3 était due à l’activation de la voie des MAPK en réponse au sn38. Nous avons donc, pour cela, traité les cellules HT29 au sn38 puis étudié par Western blot les formes actives de Erk1/2, sérine-thréonine kinases appartenant à la voie des MAPK (figure 14 B, ligne 2). Nous avons constaté que l’expression protéique de Erk1/2 n’est pas modifiée à la suite d’une inhibition des topoisomérases de type I. Par conséquent, la phosphorylation de STAT3 sur la sérine 727 observée après traitement au sn38 n’est due ni au gène suppresseur de tumeur p53, ni à la voie des MAPK.
Néanmoins, nous n’avons pas été capables de détecter la phosphorylation sur le résidu tyrosine 705 en réponse à une inhibition des topoisomérases I. Cette phosphorylation a seulement été observée après une stimulation de 30 minutes à l’IL-6 (Figure 15).
FIGURE 15| Une stimulation à l’IL-6 induit la phosphorylation des résidus tyrosine 705 et sérine 727 de STAT3. Les cellules HT29 sont privées de sérum pendant 2 jours puis sont stimulées à l’IL-6 (20ng/mL) pendant 30 minutes. L’activation de STAT3 est analysée par Western blot en utilisant des anticorps dirigés contre les formes phosphorylées de la protéine ou contre la forme non phosphorylée de STAT3. Les membranes sont réutilisées pour la tubuline, servant de contrôle de charges (n=5).
Ces résultats nous indiquent, de manière inattendue, que STAT3 est activé en réponse aux dommages de l’ADN, à la suite d’une inhibition des topoisomérases de type I. Or la phosphorylation de STAT3 est principalement connue pour avoir lieu durant la phase G1 du cycle cellulaire et en réponse à une stimulation de cytokines ou de facteurs de croissance.
Nous nous sommes alors intéressés sur l’effet de ce traitement sur la lignée cellulaire HT29. Par des études de clonogénicité, nous avons montré que le traitement au sn38 inhibe la prolifération des cellules (Figure 16A). En parallèle, une analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux, en marquant l’ADN à l’aide de l’iodure de propidium, met en évidence que cet arrêt de prolifération est dû à un blocage du cycle cellulaire pendant la phase G2 après 48h de traitement. Cependant, nous avons observé qu’une fraction des cellules meurent par apoptose. Cette population est caractérisée par la quantité de cellules présentes en subG1 (Figure 16B).
FIGURE 16| STAT3 est phosphorylé sur son résidu sérine 727 durant un arrêt en phase G2 du cycle cellulaire. A. Les cellules HT29 sont traitées ou non avec différentes concentrations de sn38 pendant 12 jours. Les colonies formées sont comptées à l’aide d’un microscope inversé et la croissance des cellules non traitées est établie à 100%. La survie des clones est ensuite obtenue de manière relative par rapport aux cellules en croissance (n=5 ± SD.). B. Les cellules HT29 sont traitées au sn38 (5ng/mL) pendant 48h puis le contenu en ADN et l’apoptose sont analysés par cytométrie en flux (n=5).
Afin de déterminer si la phosphorylation de STAT3 sur son résidu sérine 727 est due à l’induction de l’apoptose, nous avons étudié cette phosphorylation dans les cellules HCT116, une lignée colorectale différente dont la voie p53-p21waf1 n’est pas inactivée. Etant donné que cette voie de p53 est intacte, ces cellules sont capables d’entrer en sénescence. Nous avons donc tout d’abord vérifié par cytométrie en flux que les cellules HCT116 présentaient un blocage en phase G2 du cycle cellulaire, en réponse à une inhibition des topoisomérases de type I (figure 17A). Puis nous avons cherché à comprendre l’effet de ce blocage sur ces cellules. Pour cela, nous avons étudié la sénescence et la catastrophe mitotique à la suite d’un traitement au sn38 (figure 17B). La sénescence est caractérisée par un biomarqueur, la SA-β-Gal (Senescence Associated-β-Galactosidase). Par un test enzymatique, nous comptons le nombre de cellules sénescentes présentant une activité β-Galactosidase. La catastrophe mitotique est mise en évidence par comptage du nombre de cellules présentant des micronoyaux. Ces deux techniques nous permettent d’affirmer que les cellules HCT116, en réponse au sn38 et à un arrêt pendant la phase G2, entrent en sénescence mais présentent également une catastrophe mitotique plus importante.
Ces résultats confirment que l’inhibition des topoisomérases de type I dans les cellules HCT116 n’induit pas l’apoptose, mais la sénescence et la catastrophe mitotique. Par conséquent, nous avons voulu savoir si la phosphorylation de la sérine 727 de STAT3 est due au traitement utilisé et non à l’apoptose. Nous avons donc réalisé un Western blot de cette forme phosphorylée dans les cellules HCT116. La figure 17C montre que l’inhibition des topoisomérases de type I induit la phosphorylation de STAT3 sur son résidu sérine 727.
FIGURE 17| STAT3 est phosphorylé sur la sérine 727 pendant un arrêt en phase G2 du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire HCT116. A. Le contenu d’ADN des cellules HCT116 est analysé par cytométrie en flux en réponse au sn38. B. En parallèle, les cellules HCT116 sont traitées ou non au sn38 pendant les temps indiqués. Le pourcentage de cellules sénescentes est évalué par le nombre de cellules exprimant une activité SA-β-Gal et présentant des micronoyaux. C. Les cellules HCT116 sont traitées au sn38 puis l’expression de STAT3 phosphorylé sur la sérine 727 est analysée par Western blot en utilisant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine. La tubuline est utilisée en contrôle de charge.
Ainsi, cette étude suggère que la phosphorylation de STAT3 sur son résidu sérine 727 n’est pas due à l’apoptose et indique que cette modification n’est pas spécifique d’une lignée cellulaire. De plus, ces expériences mettent en évidence que le facteur de transcription est phosphorylé sur la sérine 727 en réponse à une inhibition des topoisomérases I.