La spectroscopie de uorescence, ou bien uorométrie ou spectro uorométrie est un type de spectroscopie électromagnétique qui analyse la uorescence d'un élément. La croissance rapide de l'intérêt à la spectroscopie de uorescence s'explique en partie par le développement de nou- velles sources lumineuses ; Udd (1991), ainsi que l'évolution au niveau de la compréhension scienti que du phénomène de la uorescence ; le fait que beaucoup plus d'informations sont contenues et peuvent être extraites d'une uorescence. Cette compréhension, entre autres, a été facilite par la course au génome humain. Depuis 1985, le séquençage de l'ADN est accompli presque exclusivement en utilisant des sondes uorescentes ; Valeur and Brochon(2001). L'application de cette technologie pour les CCFO (section 1.6) trouve de nombreux champs d'application, dont la détection d'halogénures en utilisant l'extinction de la uorescence ;
Geddes (2000). Cette section du mémoire vient introduire des dé nitions et de l'explication des principes fondamentaux de la spectroscopie de uorescence, dans l'optique d'établir les facteurs importants au développement de CCFO à base de uorescence.
1.7.1 Interactions lumière-matière
Les interactions lumière-matière entre un matériau et une onde lumineuse incidente produisent de nouvelles ondes électromagnétiques. Ces phénomènes de photoluminescence proviennent des
échanges énergétiques présents dans un système moléculaire luminescent ;Atkins et al.(2018). Les diérents types de transitions non radiatives et radiatives pouvant se produire dans les molécules sont souvent représentés par un diagramme, nommé diagramme de Perrin-Jablonski, du type de celui illustré par la Figure 1.16. L'axe vertical indique le niveau d'énergie, tandis
S0 S00 S1 S10 S2 S20 S3 S30 S01 S02 S03 S11 S12 S13 S21 S22 Singulet T0 T00 T1 T10 T01 T02 Triplet Iπ Absorption Fluorescence (rapide) Phosphorescence (indirecte, lente) Relaxation vibrationnelle Croisement intersyst`eme
Figure 1.16: Représentation des échanges énergétiques présents dans un système moléculaire luminescent, nommée diagramme de Perrin-Jablonski.
que les états sont groupés horizontalement selon leur multiplicité de spin. Ce sont les niveaux d'énergie pour une molécule ayant π orbitaux. Les états Singulet (S) et Triplet (T ) sont séparés pour plus de clarté. Les transitions non radiatives sont symbolisées par des èches droites tandis que les radiatives le sont par des èches ondulées. Le niveau d'ionisation Iπ est
a ché en haut. Les états excités, ainsi que les sous-niveaux vibrationnels (lignes horizontales en pointillés), sont schématisés à la Figure 1.16.
Lorsqu'une molécule se trouve dans un état excité suite à l'absorption d'un photon (à savoir., le quantum d'énergie associé aux ondes électromagnétiques), elle retourne au plus bas niveau d'énergie de l'état excité S1 par relaxation vibrationnelle (transfert d'énergie). La molécule
revient par la suite à l'état fondamental S0 par deux types de transition, qui permettent à la
molécule excitée de dissiper son énergie excédentaire : non radiatives et radiatives. Si l'émission radiative se produit entre deux états (Singulet excité et Singulet fondamental), le phénomène est appelé uorescence. Si l'émission se produit entre (TripletSingulet fondamental), le phé- nomène est appelé phosphorescence.
La relaxation vibrationnelle est un processus non radiatif, tandis que la uorescence et la phos- phorescence sont radiatives. Dans le cas de la phosphorescence, le passage à l'état s'eectue
avec une transition de T0 à S0 (croisement intersystème). Elle est, ainsi, lente et indirecte (en
interactions avec d'autres molécules).
1.7.2 Fluorescence
La uorescence est un phénomène très intéressant, résultat des interactions de la lumière et de la matière. Observée pour la première fois en 1560 par Bernardino de Sahagún ; Jameson
(2014), la uorescence a évolué pour devenir une technique qui trouvent des applications dans quasiment tous les domaines de la science au sens large : astronomie, biophysique, physique atomique, nucléaire, physique du solide, acoustique, chimie, biochimie, biologie, médecine de pointe, etc. ;Grant et al.(2002);Valeur and Brochon(2001);Jameson(2014);Wu et al.(2017). Les transitions énergétiques discrètes représentées par le diagramme Figure 1.16peuvent être écrites sous la forme d'énergie E de photon, soit Équation 1.7:
Ephoton = h νEX ou EM, (1.7)
où ν représente la fréquence (νEX pour excitation et νEM pour émission) et h est la constante
de Planck.
L'étude expérimentale du spectre du phénomène de la uorescence, c'est-à-dire de sa décompo- sition sur une échelle d'énergie, ou toute autre grandeur se ramenant à une énergie (fréquence, longueur d'onde, etc.), nommée spectroscopie, permet de fournir des spectres d'énergie. Ces spectres sont appelés respectivement spectre d'excitation de uorescence et spectre d'émission de uorescence. L'émission de uorescence peut généralement être observée avec une énergie plus faible (longueur d'onde plus longue) que l'excitation, ce qui peut être directement déduit du diagramme de Jablonski (Figure 1.16). Ce changement de couleur d'émission de uores- cence par rapport à la couleur de la lumière incidente a été observé pour la première fois par le scienti que George Stokes en 1852 et s'appelle le décalage de Stokes ; Lakowicz(2006). Pratiquement toutes les données de uorescence, à l'exception de certains paramètres rencon- trés en microscopie à uorescence, appartiennent à l'une des cinq catégories suivantes :
1. Le spectre d'émission ; il est l'enregistrement de la variation de l'intensité de la lumière émise en fonction de la longueur d'onde, tandis que l'échantillon est illuminé à une longueur d'onde d'excitation xe.
2. Le spectre d'excitation ; pour obtenir ce paramètre, la longueur d'onde d'émission est xée, pendant que la variation de l'intensité de uorescence est enregistrée lorsque la longueur d'onde d'excitation est modi ée. Typiquement, le spectre d'excitation englobe une large plage de longueurs d'onde, qui correspond souvent, mais pas toujours, au spectre d'absorption du uorophore.
3. Le rendement quantique ; il correspond au rapport du nombre de photons émis au nombre de photons absorbés. Par exemple, si une solution de uorophore absorbe 100 photons puis émet 100 photons, son rendement quantique est de 100% ou 1.
4. La durée de vie de l'état excité ; elle est une mesure du temps entre l'absorption d'un photon par un uorophore et l'émission ultérieure d'un photon, c'est-à-dire pendant le temps écoulé entre l'absorption et l'émission de la lumière. Une évaluation précise de la durée de vie de la uorescence nécessite de suivre de nombreux processus d'absorption et d'émission a n de générer les statistiques nécessaires.
5. La polarisation/anisotropie ; ils sont deux paramètres diérents, mais très liés. Ils me- surent l'orientation du uorophore par rapport à un axe particulier, généralement l'axe vertical, au moment de l'émission de la uorescence. Ces fonctions décrivent le mouve- ment/ou l'absence de mouvement d'un uorophore au cours de sa durée de vie excitée.
1.7.3 Fluorophores
Un complexe uorescent aussi appelé indicateur ou uorophore est une substance chimique capable d'émettre de la lumière uorescente après excitation par une lumière de longueur d'onde dé nie (lumière d'excitation). Les progrès de la chimie de la uorescence, ainsi que les multiples découvertes techniques (depuis déjà 100 ans), ont alimenté le développement de nombreux types de uorophores. Quelques substances uorescentes courantes ( uorophores) sont représentées par la Figure 1.17. La vaste sélection de uorophores ore aujourd'hui une
Figure 1.17: Fluorescence de diérentes substances sous ultraviolets. Le violet est POPO, le bleu est la Quinine Sulfate, le vert est une Fluorescéine, le jaune est l'Acridine orange, l'orange est la Rhodamine B, le rouge est la Pyridine-1 ;Lakowicz (2006).
exibilité, une variation et des performances de uorophore plus élevées que jamais pour les applications de recherche. Les uorophores peuvent être divisés en quatre classes : Liu et al.
(2013) :
protéines et peptides, composés organiques,
oligomères et polymères synthétiques, systèmes multi composants.
Chaque uorophore a des caractéristiques distinctes, qui doivent être prises en compte lors du choix du uorophore à utiliser pour une application ou un système expérimental donné. Il
existe un grand choix de uorochromes, chacun pouvant être caractérisé par ses spectres d'ex- citation et d'émission. La plupart des uorophores sont inertes ;Liu et al.(2013), mais certains modi ent leurs propriétés de uorescence en fonction des conditions physiques et chimiques de l'environnement local ; Brown and POUJOL (2009) Valeur and Brochon (2001), notam- ment la présente de certains ions éventuelles interactions avec d'autres molécules (quenchers) (Figure 1.18). Un uorophore qui réagit alors avec l'analyte, présent dans le milieu extérieur,
Fluorophores Temp´erature Pression pH Ions Polarit´e Viscosit´e Quenchers
Figure 1.18: Diagramme de diverses conditions physiques et chimiques auxquelles les uoro- phores peuvent répondre.
permet de mesurer des processus chimiques ou biochimiques. Pour que cette réaction soit bonne, l'indicateur doit être sensible à la molécule que l'on souhaite détecter (ions chlorure dans le cas de cette étude).
À moins que le uorophore ne soit détruit de manière irréversible à l'état excité (un phénomène important connu sous le nom de photoblanchiment, voir ci-dessous), l'ensemble du processus de uorescence est cyclique. En fait, un uorophore peut être excité et détecté à plusieurs reprises. Le fait qu'un seul uorophore puisse générer plusieurs milliers de photons détectables est fondamental pour la grande sensibilité des techniques de détection de uorescence.
1.7.4 Extinction de la uorescence
L'intensité de la uorescence peut être diminuée par une grande variété de processus ; Lako- wicz (2006); Demchenko (2009). De telles diminutions d'intensité s'appellent l'extinction ou bien quenching. Elle peut se produire par diérents mécanismes provoquant la perte d'inten- sité lumineuse émise par un échantillon et la réduction de la durée de vie de la uorescence (Figure 1.19). Ces mécanismes proviennent du retour d'une molécule à l'état excité vers son
niveau fondamental sans émission de lumière (Figure 1.16).
Temps
Fluorescence
Quenching
Figure 1.19: Esquisse illustrant comment l'extinction entraîne une réduction de la durée de vie de la uorescence.
Le quenching peut être soit un processus souhaité, tel que le transfert d'énergie ou d'élec- trons, soit une réaction secondaire indésirable qui peut diminuer le rendement quantique d'un processus photochimique souhaité. Deux processus d'extinction sont considérés dominants, et sont les plus couramment utilisés pour des applications : l'extinction par collision (dynamique) et l'extinction statique (formation de complexe) ; Geddes(2001);Lakowicz (2006).
1.7.4.1 Extinction dynamique
Une extinction par collision, ou encore dynamique se produit lorsque le uorophore à l'état excité est désactivé lors du contact avec une autre molécule en solution, appelée l'extincteur quencher (Q). Dans ce cas, le uorophore revient à l'état fondamental lors d'une rencontre par diusion avec l'extincteur. Par le fait même, la fréquence de ces extinctions suit une relation statistique reliée à la concentration de Q en solution, c'est à dire, si une collision se produit alors que le uorophore est encore à l'état excité, son énergie passera vers le second élément selon diérents mécanismes d'où le caractère dynamique. Toutefois, les molécules ne sont pas modi ées chimiquement durant ce processus. Pour l'extinction par collision, la diminution d'intensité est décrite par la 'célèbre' équation de Stern-Volmer (Équation 1.8).
I0
I = τ0
τ = 1 +KQ[Q] (1.8)
Dans cette expression, KQest la constante d'extinction de Stern-Volmer, I0 et I sont les inten-
τ0 est la durée de vie naturelle de la uorescence en l'absence de Q, τ est la durée de vie ré-
duite, et [Q] est la concentration d'extincteur. Ainsi, les performances en termes de sensibilité et de sélectivité d'un uorophore face à un quencher sont directement liées à la constante de Stern-Volmer. Le mécanisme d'extinction varie selon le couple uorophore/extincteur. Une grande variété de molécules peut agir comme extincteur de collision par exemple : oxygène, les halogènes, les amines et les molécules dé cientes en électrons telles que l'acrylamide ;Lakowicz
(2006). Notamment, les ions halogénure comme l'iodure, le bromure, et le chlorures peuvent favoriser plus e cacement l'extinction de certains uorophores.
1.7.4.2 Extinction statique
Outre l'extinction par collision, une extinction par uorescence peut avoir lieu par divers autres procédés. Les uorophores peuvent former des complexes non uorescents avec les agents d'extinction. Ce processus est appelé extinction statique puisqu'il se produit à l'état fondamental et ne repose pas sur des collisions moléculaires ou par diusion. L'extinction statique peut former des complexes ou des liaisons covalentes avec un analyte, rendant la forme nale de la molécule non uorescente c'est-à-dire, un état fondamental est non uorescent. Dans un tel cas, la dépendance de la uorescence en fonction de la concentration en quencher suit la relation suivante (Équation 1.9) :
I0
I = τ0
τ = 1 +Ks[Q], (1.9)
où Ks est la constante d'extinction statique. Ici, la dépendance de II0 vis-à-vis de [Q] est
également linéaire et très similaire à celle observée pour l'extinction dynamique, sauf que la constante d'extinction est maintenant la constante d'association du complexe. L'extinction statique et dynamique peut également être distinguée par les eets de la température ;Geddes
(2001). Si le quenching est statique, il diminue avec l'augmentation de la température en raison de la perturbation des complexes moléculaires qui produisent. Au contraire, l'extinction dynamique augmente en raison d'une augmentation du taux de diusion de l'extincteur. La désactivation statique et dynamique peut être utilisée pour fournir la réponse de uorescence. En technologie de détection, la cible ou l'analyte peut être utilisé comme un extincteur et sa concentration peut être déterminée par les expressions : Équation 1.8 et Équation 1.9. Tout de même, l'extinction de la uorescence statique et dynamique peuvent se produire simultanément, une forme modi ée de l'équation de SternVolmer est, alors à utiliser ;Geddes
(2001).
1.7.5 Photoblanchiment
Le photoblanchiment, ou encore le blanchiment optique correspondent à la perte de uores- cence d'une molécule soumise à une excitation intense. À l'état excité, un uorophore est engagé dans une réaction photochimique qui va empêcher son retour à un état excitable. Il
s'agit généralement d'une réaction avec l'oxygène ; Eggeling et al. (1998). Plus on excite un uorophore, plus la proportion de uorophore photoblanchi est grande, jusqu'à extinction. Au- trement dit, le processus cyclique d'excitation-émission de la uorescence peut être brisé par photoblanchiment durant de longs temps de mesure, et à force de répéter le cycle d'excitation- émission d'une molécule uorescente, le photoblanchiment moléculaire devient plutôt favorisé. De plus, la perte de signal de uorescence est irréversible si la population de uorophores blan- chis n'est pas reconstituée (par exemple, par diusion) ; Axelrod et al. (1976). L'étendue du photoblanchiment dépend de la durée et de l'intensité de l'exposition à la lumière d'excitation (Figure 1.20). Cet eet irréversible est, alors, dépendant de l'environnement chimique (gaz dissout, solvant, température, etc.), mais aussi du nombre photons déjà émis par la molécule. Il dépend, aussi, du uorophore ; vu que chacun présente une cinétique de photoblanchiment particulière.
Excitation
Temps d'excitation
Avant excitation Perte de fluorescence
Région fluorescente (échantillon)
Figure 1.20: Illustration de la perte de uorescence suite au photoblanchiment.
Finalement, le photoblanchiment du uorophore excité devient le principal facteur limitant l'utilisation de la spectroscopie de uorescence comme étant une technique de détection des analytes. Le remède le plus e cace contre le photoblanchiment consiste à maximiser la sensibi- lité de détection, ce qui permet de réduire l'intensité de l'excitation. La sensibilité de détection est améliorée par les dispositifs d'excitation de faible luminosité, ainsi que par les ltres d'émis- sion passe-bande les plus larges compatibles avec une isolation de signal satisfaisante.