6.2.2 - Spectre Raman

Lors de l'interaction entre l'échantillon et le faisceau incident, les électrons mis en jeu passent brièvement par un état virtuel d'énergie beaucoup plus forte que les transitions vibrationnelles et rotationnelles de l'échantillon [21].

IV.6.2.3 Appareillage

Comme les spectromètres IR, on distingue deux grands types d’appareillage : les spectromètres Raman conventionnels (figure-IV.9-)et les spectromètres Raman par transformée de Fourier.

L’introduction de l’informatique a permit de coordonner les mesures effectuées à la vitesse de déplacement du réseau (spectromètres Raman) ou au déplacement du miroir dans l’interféromètre Michelson (Spectromètre à Transformé de Fourier)( figure-IV.10-), identique à celui utilisé en infrarouge, qui permet la séparation des rayonnements en enlevant le bruit de fond du à la fluorescence, qui masque les signaux intéressants.

IV .6. 3- Spectre RAMAN et spectre d’absorption Infrarouge

Figure-IV.9-: Schéma de fonctionnement d’un spectromètre Raman classique

Pour les molécules polyatomiques, on obtient les mêmes informations à l’aide des bandes d’absorption de vibration pure et des raies RAMAN de vibration.

En effet, il est difficile d’observer pratiquement le spectre de rotation Raman et peu utilisé par contre, le spectre de rotation-vibration reste la meilleure source d’informations. L’effet RAMAN constitue un complément non négligeable dans l’étude des structures puisque certaines transitions ne sont pas actives en absorption infrarouge dans le cas, par exemple, des molécules diatomiques homonucléaires et qu’elles le sont en Raman. Comme on peut trouver certaines transitions actives en spectroscopie infrarouge ne le sont pas en Raman.

IV .7-La spectroscopie vibrationnelle appliquée aux biomolécules

La spectroscopie infrarouge est une méthode d’analyse physique rapide, simple à mettre en œuvre et ne nécessitant que peu de quantité de matière à analyser. Dans une macromolécule biologique, toutes les vibrations de groupes chimiques qui impliquent une variation du moment dipolaire électrique permanent du groupe absorbent dans le domaine infrarouge.

Les méthodes spectroscopiques sont utilisées pour analyser les macromolécules parce que ce sont des techniques d'analyse non destructrices. La structure des protéines a depuis longtemps été étudiée par des techniques de spectrométrie vibrationnelle, telle que la spectrométrie IR et Raman. Ces structures donnent lieu à de nombreuses bandes vibrationnelles pas toutes observables à la fois par spectrométrie Raman et IR [22-23]. Nombreux sont les travaux de spectroscopie vibrationnelle réalisés sur les protéines dont il est impossibles de les énumérés tous. Parmi ces travaux, on peut citer ceux effectués par Supaporn Dokmaisrijan et al.

[24-30].

Les spectres Raman des protéines présentent une bande dans le domaine 890-945 890 −

945 associée à l’élongation de la liaison C-C qui est caractéristique des hélices α. Pour

les feuillets β, une bande caractéristique apparaît à 1020 − 1060 . La présence d’acides

aminés soufrés (Cystéine et Méthionine) et d’acides aminés aromatiques dans la structure des protéines donnent également lieu à l’apparition de bandes spécifiques sur les spectres Raman. Pour les premiers, la formation de ponts disulfure donne lieu à plusieurs bandes Raman,

notamment celle associé à l’élongation de la liaison S-S à 500 − 550 . Pour les acides

aminés à chaîne latérale aromatique (Phénylalanine -Phe, Tyrosine -Tyr, Tryptophane -Trp, Histidine - Hys), le cycle aromatique donne lieu à des bandes Raman caractéristiques comme

intense en Raman n’est pas sensible à l’environnement de l’acide aminé, elle peut ainsi être utilisée pour normaliser le spectre Raman. D’autres bandes caractéristiques des acides aminés

aromatiques apparaissent autour de 1600 (1605 Phe,1584 Phe, Tyr et Trp,

1618 Trp). Pour la Tyrosine, des bandes Raman intenses majoritairement associées au

cycle aromatique se trouvent à 1255, 1210, 1176, 850, 830 et 643 . Le doublet de

Fermi à 830 et 850 indique la présence ou non de liaisons hydrogène et renseigne sur

l’environnement de l’acide aminé. Pour le Tryptophane, le doublet de Fermi à

1340 et 1360 est un marqueur de l’hydrophobicité du milieu [23]. Certains acides

aminés sont précurseurs de petites molécules .Le tryptophane est le précurseur de la sérotonine (neurotransmetteur). La Sérine intervient dans la biosynthèse de la sphingosine, un intermédiaire de synthèse des sphingolipides. L’histamine, un puissant vasodilatateur est produit par décarboxylation de l’Histidine. L'acide Aspartique joue un rôle dans la biosynthèse des bases pyrimidiques et puriques des nucléotides. La Tyrosine est à l'origine de la thyroxine, hormone thyroïdienne, ou de neurotransmetteurs comme la dopamine. La Glycine est utilisée dans la biosynthèse des porphyrines. La spectrométrie de masse offre aujourd’hui la possibilité d’analyser des biopolymères naturels, protéines, oligonucléotides ou polysaccharides : l’enchaînement en acides aminés, en nucléotides, ou en monosaccharides peut ainsi être déchiffré, et les interactions inter- et intramoléculaires caractérisées dans le cas

d’associations supramoléculaires [31]. Les analyseurs ont également évolué, grâce au

perfectionnement de ceux existant ou au développement de nouveaux instruments hybrides. Les perfectionnements des instruments ont ainsi conduit à des améliorations spectaculaires de la sensibilité et de la résolution, dont la biologie a profité à travers l’essor d’applications variées telles que la protéomique, la peptidomique, la glycomique, la lipidomique ou la métabolomique. De plus, le couplage aisé avec des techniques chromatographiques ou électrophorétiques a permis d’améliorer rapidement les limites de détection, trouvant ainsi d’autres applications comme l’analyse de produits pharmaceutiques lors de contrôles de qualité ou encore la quantification de produits actifs pour des études pharmacocinétiques. L’analyse des acides aminés joue un rôle important dans les industries alimentaires, pharmaceutiques mais aussi dans le domaine de la valorisation des produits naturels.

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