Spécificités de la réparation liée à la fourche de réplication 1 Blocages de fourches et CDBs dues à l’hydroxyurée

Il a été montré que l’utilisation de HU à une même concentration (2mM) dans des cellules U2OS avait un effet différent sur la fourche de réplication en fonction du temps de traitement et faisait intervenir deux mécanismes Rad51 dépendants distincts (Petermann et al., 2010). Les traitements dits « courts » d’une à deux heures entrainent un blocage de fourche (« stalling ») alors qu’une utilisation du HU sur un temps plus long (à partir de 18h de traitement) induit des CDBs (mesurées par PFGE, Pulsed-field gel electrophoresis) souvent associées à l’effondrement de la fourche (« collapse ») qui sont prises en charge par le HR (Lundin et al., 2002; Petermann et al., 2010). Contrairement aux cellules humaines, ce phénomène d’induction de CDBs après HU n’est observée chez la levure que lorsqu’elle est mutée pour les protéines du point de contrôle de la phase S (Hanada et al., 2007; Saintigny et al., 2001).

On définit un « stalling » de fourche comme un ralentissement ou un arrêt de la fourche de réplication mais durant lequel tous les éléments de la fourche restent assemblés, la protégeant de la formation de structures secondaires, ce qui permet au réplisome de redémarrer. A l’inverse, lorsqu’une fourche « collapse », les éléments du réplisome se dissocient et une intervention du HR est nécessaire pour son redémarrage (Lambert and Carr, 2013b). Le mécanisme qui entraine un collapse de fourche et une accumulation de cassures suite à un « stalling » a fait l’objet de plusieurs recherches cette dernière décennie mais n’est pas encore complètement défini. Il a été proposé que le désassemblage du réplisome a lieu après un traitement HU lorsque le point de contrôle en phase S est déficient (Branzei and Foiani, 2010;

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Cobb et al., 2005) ; cependant d’autres études ont montré que le réplisome restait intact après un traitement au HU dans des mutants de levures (De Piccoli et al., 2012). L’une des explications possibles serait que le réplisome reste intact mais qu’il se déplace, exposant ainsi l’ADN nouvellement synthétisé aux éxo/endonucléases et entrainant un collapse de fourche irréversible associé à une cassure double brin (Yeeles et al., 2013). Une autre explication serait qu’au niveau d’un réplisome dissocié, l’hélicase peut continuer à séparer les brins parentaux et générer de l’ADN simple brin.

La dissociation du réplisome a pour conséquence l’accumulation d’intermédiaires de réplication qui seront des initiateurs de la recombinaison homologue. Par conséquent le HR joue un rôle fondamental dans la progression de la réplication en agissant à plusieurs niveaux : il peut prendre en charge le ssDNA accumulé suite à une dissociation du réplisome, il protège l’ADN néosynthétisé d’éventuels résections, et il a récemment été suggéré comme acteur dans la reconstruction d’un réplisome après effondrement, permettant le redémarrage de la fourche (Carr and Lambert, 2013).

4.5.2 Prise en charge des cassures induites à la fourche

La recombinaison homologue (HR) escorte la machinerie de réplication tout au long de la phase S. L’inhibition de l’expression de Rad51 dans des cellules de poulet entraine l’accumulation de cassures chromosomiques suite à la réplication, ce qui montre bien que le HR est requis au cours de la progression normale en phase S (Helleday, 2003). Après déstabilisation de la fourche par un traitement court au HU, Rad51 forme des foyers au niveau de la fourche sans pour autant induire le HR. Ces foyers seraient associés à la régression de la fourche qui faciliterait la formation de jonctions de Holliday et le redémarrage de la fourche. Ce mécanisme bien décrit chez les bactéries et les levures est appelé Réplication Induite Par les Cassures (BIR pour Break Induced Repair). Ce type de réparation spécifique de la fourche de réplication prend en charge les CDBs caractérisées par la présence d’homologies de séquence à une seule extrémité de la cassure. Dans ce cas précis l’extrémité de la CDB envahit le brin homologue et initie la synthèse, formant une structure en boucle qui permet de restaurer la fourche de réplication et forme des jonctions de Holliday qui seront ensuite résolues (Helleday, 2003). Chez les mammifères, la preuve formelle de l’existence de ce type de réparation n’a pas été faite. Cependant le travail récent de Costantino et al. (Costantino et al., 2014) utilisant un nouveau plasmide fluorescent ayant la capacité de mesurer la réparation par BIR, a permis d’identifier la polymérase POLD3, hortologue de Pol32 chez S. cerevisiae, comme facteur de réparation par BIR chez l’Homme. Il suggère que l’observation de

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duplication génomique dans certains cancers surexprimant POLD3 serait due à son activité dans le BIR à la fourche de réplication qui est connue pour être très mutagène (Deem et al., 2011).

4.5.3 Le redémarrage de la fourche de réplication

Les mécanismes par lesquels le HR assure la protection et le redémarrage de la fourche de réplication chez les mammifères sont encore mal connus. Plusieurs protéines ont toutefois été identifiées comme essentielles à ce processus. Il a notamment été montré que PARP-1 était requise pour le recrutement et la formation de foyers Mre11 au niveau de la fourche de réplication (Bryant et al., 2009). Le recrutement de Mre11 est critique pour le redémarrage de la fourche puisqu’il contribue à la résection des structures intermédiaires et à l’initiation de la recombinaison homologue (Williams et al., 2008). BRCA1, FANCD2 et BRCA2 sont également recrutées afin de protéger la fourche d’une résection excessive Mre11 dépendante (Yeo et al., 2014; Ying et al., 2012) et le recrutement de BRCA2 permet celui de Rad51 qui est requis pour la réparation des CDBs à la fourche (Petermann et al., 2010). Ces deux fonctions de protection et de réparation HR dépendantes de Rad51 sont distinctes, même si elles font intervenir plusieurs protéines communes. Par exemple le recrutement de Rad51 sur le ssDNA est suffisant pour induire la réparation par HR, alors que la stabilisation de la fourche exige un nucléofilament de Rad51 stablement accroché à la partie C-terminale de BRCA2.

Il a également été suggéré que les cellules eucaryotes ont la capacité d’éviter le redémarrage de la fourche de réplication par l’initiation d’origines dormantes adjacentes à la fourche (Branzei and Foiani, 2007; Paulsen and Cimprich, 2007). Cette observation avait été confirmée par les travaux de Petermann et al. qui montrent qu’après un traitement de 24h au HU les cellules ont tendance à initier de nouveau évènements et non à redémarrer les fourches bloquées (Petermann et al., 2010).

5. RPA : une protéine multifonctionnelle essentielle au maintien de l’intégrité du