L’inhibition de Cdk5 sensibilise les cellules à l’inhibition de DNA-PK

Afin de comprendre dans quelle voie de signalisation Cdk5 pourrait être impliquée, j’ai testé l’effet de l’inhibition de Cdk5 sur les différents inhibiteurs de PI3K : ATM ATR et DNA-PK. Pour cela, j’ai fait des survies clonogéniques dans les lignées HeLa Contrôles et HeLa Cdk5 KD en absence et en présence de ces inhibiteurs, dans un premier temps sans traitement par des RI. Les résultats des survies sont représentés ci-dessous (Figure 33).

125 ATMi (10µ M) ATRi (10µ M) DNA- PKi ( 2µM) 0.0 0.5 1.0 1.5 HeLa Contrôles HeLa Cdk5 KD F ra c ti o n d e s u rv ie

Figure 33: Survie clonogénique des lignées HeLa Contrôles et HeLa Cdk5 KD traitées avec des inhibiteurs de PI3K

Les lignées HeLa asynchrones sont ensemencées en triplicat et traitées avec les inhibiteurs (ATMi : NU55933, 10 µm),(ATRi :NU6027, 10 µM), (DNA-PKi : NU7441, 2 µM), 24 heures après traitement, les cellules sont rincées et remises en incubateur pendant 12 jours. Les cellules sont ensuite fixées et comptées, les fractions de survies aux différentes doses d’inhibiteurs sont représentés ci-dessus, les données sont la moyennes de 4 expériences indépendantes. Les résultats sont statistiquement différents dans le cas de l’inhibiteur de DNA-PK (P <0.0001). Sur le panel de droite, survie clonogénique après 24h de traitement avec une gamme de concentrations de NU7441.

Les résultats des survies présentées (Figure 33), montrent que l’inhibition de Cdk5 ne sensibilise pas les cellules aux inhibiteurs d’ATM ou d’ATR. En revanche, la déplétion en Cdk5 sensibilise de façon significative à l’inhibition de la DNA-PK par traitement au NU7441, et ce à toutes les concentrations testées. J’ai également confirmé cet effet par l’utilisation d’un autre inhibiteur de DNA-PK (NU7026, résultats non présentés). Cette sensibilité exacerbée à l’inhibition de Cdk5 en absence de dommages suggère une implication de Cdk5 dans une voie de signalisation importante pour la survie cellulaire différente de la voie DNA-PK dépendante.

Nous avons voulu savoir si l’inhibition de DNA-PK avait un effet différent en présence et en absence de Cdk5 sur la survie cellulaire après induction de dommages. Pour cela j’ai effectué d’autres survies clonogéniques dans les lignées HeLa Contrôles et Cdk5 KD, en traitant les différentes lignées simultanément avec un inhibiteur de DNA-PK (pendant 24h) et des rayons, les résultats sont présentés Figure 34.

0.1 1.0 0 1 2 3 4 5 6 Controls Cdk5 KD R el at iv e ce ll s ur vi va l [NU7441] mM

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Figure 34: Survie clonogénique des lignées HeLa Contrôles et HeLa Cdk5 KD après irradiation en présence de l’inhibiteur de DNA-PK NU7441

Les lignées HeLa asynchrones sont ensemencées, traitées avec l’inhibiteur de DNA-PKi (NU7441, 1 µM) pendant 1h ou avec du DMSO seul (en noir) puis irradiées avec une source de 137Cs et l’inhibiteur est enlevé par rinçage 23h après l’irradiation. Après 10 à 15 jours de croissance, les cellules sont fixées et comptées, les fractions de survies aux différentes doses sont représentées ci-dessus, les données sont des moyennes de 2 expériences indépendantes réalisées en triplicat avec les quatre clones (« Controls » étant la moyenne des 2 clones Contrôles et « Cdk5 KD » la moyenne des 2 clones Cdk5-1499, Cdk5-1500).

L’inhibition de DNA-PK entraine une grande radiosensibilisation des lignées HeLa et les conséquences de l’absence de Cdk5 sont plus importantes en termes de survie cellulaire lorsque la DNA-PK est inhibée. En effet, le ratio des SF2 des lignées Contrôles vs Cdk5 KD est de 1,25 en moyenne sans inhibiteur et de 2,25 en présence de NU7441.

De la même façon, nous avons voulu savoir si la présence de l’inhibiteur de DNA-PK modifie la réponse au HU, pour cela nous avons traité les cellules pendant 24 heures au HU (2 mM), puis inhibé la DNA-PK pendant 24 heures. Les résultats de la survie clonogénique sont représentés figure 35.

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Les lignées Hela asynchrones sont ensemencées puis traitées pendant 24heures au HU afin de bloquer les fourches de réplication et d’induire des lésions à l’ADN ou laissées sans traitement. Les cellules sont rincése et traitées à l’inhibiteurs de DNA-PK NU7441 pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite rincées et incubées dans du milieu sans drogue, au bout de 12 jours de croissance, les colonies sont fixées et compteés. Les fractions de survies aux différentes concentrations sont représentées ci-dessus, les données sont des moyennes de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat avec les quatre clones (« Controls » étant la moyenne des 2 clones Contrôles et « Cdk5 KD » la moyenne des 2 clones Cdk5-1499, Cdk5-1500).

L’ensemble des résultats obtenus après inhibition de la DNA-PK et induction de dommages par irradiation gamma ou traitement HU montre que la fonction de la DNA-PK est nécessaire à la survie des cellules en l’absence de la kinase Cdk5. Ces observations suggèrent un rôle pour le NHEJ dans la réparation des dommages induits par les radiations et par un stress réplicatif dans les cellules déficientes pour Cdk5.

3.6 Conclusions

Dans l’ensemble, nos résultats indiquent qu’en réponse aux RI, Cdk5 est requise pour une bonne efficacité des points de contrôle du cycle cellulaire, en phase S et en phase G2 et pour la survie cellulaire, plus particulièrement en phase S. Notre analyse de l’activation des voies de signalisation des dommages dépendantes d’ATM et ATR n’a pas permis de mettre en évidence de défaut en absence de Cdk5, suggérant que la mise en place des arrêts du cycle peut se faire en absence de Cdk5. On peut imaginer que l’implication de Cdk5 se situerait

0.1 1.0 0 1 2 3 4 5 6 Controls Controls + HU Cdk5 KD Cdk5 KD + HU R el at iv e ce ll su rv iv al [NU7441] mM

Figure 35 Survie clonogénique des lignées HeLa Contrôles et HeLa Cdk5 KD à l’inhibiteur de DNA-PK associé aux HU

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plutôt au niveau des mécanismes contrôlant le maintien de ces points de contrôle par la régulation de l’activité de protéines comme PLK1 (Polo-like kinase 1) par exemple en ce qui concerne l’arrêt en G2. Nos travaux ont montré un rôle de Cdk5 dans le contrôle des fourches de réplication après un stress réplicatif, il est envisageable que la fonction de Cdk5 dans la répression de l’initiation des fourches s’exerce également après exposition aux RI (Willis and Rhind, 2009). L’activation d’effecteurs plus en aval du processus tels que CDC25 et le complexe Cyclin E/Cdk2 doit être étudiée.

L’altération des points de contrôle du cycle peut contribuer à la diminution de la survie cellulaire observée après irradiation, la réduction de l’arrêt en G2 peut notamment entrainer des défauts de ségrégation des chromosomes qui conduisent à la mort cellulaire. Les défauts de réparation des dommages radio-induits sont également des causes majeures de radiosensibilité. L’absence de défaut de religation des cassures simple brin de l’ADN induites par les rayons observée par l’analyse par élution alcaline (Bolin et al., 2012) ainsi les tests comètes (Figure 3 de l’article) suggèrent que la réparation de ces dommages radio-induits se fait correctement dans les cellules déplétées pour Cdk5. De plus, l’absence de sensibilité à la néocarcinostatine suggère également que la protéine Cdk5 n’est pas essentielle à la réparation des cassures double brin induite de manière directe (Bolin et al., 2012). Nous avons également mesuré le nombre de cassures résiduelles 24 heures après un traitement de 2 Gy par la quantification des foyers H2AX et 53BP1. Les résultats obtenus dans les lignées Cdk5 KD sont similaires à ceux des lignées Contrôles (données non présentées).

Néanmoins, la sensibilité des cellules déplétées pour Cdk5 à l’inhibition de la DNA-PK suggère que la réparation de cassures double brin par NHEJ joue un rôle prépondérant dans les lignées Cdk5 KD. Les résultats de Patel et al. (Patel et al., 2011) qui avaient revisité le modèle de létalité synthétique, ont montré que la sensibilité des cellules déficientes pour BRCA1 aux inhibiteurs de PARPs n’était pas due au rôle de la protéine PARP-1 dans la réparation de certains dommages simple brin, mais à une augmentation de la réparation par la voie du NHEJ. En effet, la réparation des cassures double brin par NHEJ est extrêmement « error-prone » et de fait génère un niveau élevé de réarrangements chromosomiques qui induisent la mort cellulaire (Helleday, 2011). Etant donné que les lignées Cdk5 KD présentent également une sensibilité augmentée aux inhibiteurs de PARP, nous pouvons faire l’hypothèse que les CDBs formées en réponse aux radiations et plus particulièrement au niveau des fourches de réplication, pourraient être réparées par le NHEJ en absence de Cdk5. (voir Figure 36). Afin de tester cette hypothèse il faudrait faire des analyses cytogénétiques pour mesurer les aberrations chromosomiques telles que les cassures chromosomiques, les

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structures radiales... Une analyse des micronoyaux serait également intéressante et enfin, il est possible de faire une mesure directe de l’efficacité du NHEJ par transfection de plasmides spécifiques dans les cellules (Guirouilh-Barbat et al., 2004).

DNA damage