5. RPA : une protéine multifonctionnelle essentielle au maintien de l’intégrité du génome
5.2 Rôles de la protéine RPA
L’identification et la compréhension du rôle de la protéine RPA dans la réplication ont été possibles grâce à l’étude de la réplication du virus SV40 (Fairman and Stillman, 1988; Wold and Kelly, 1988). Dans ce système qui requiert la fonction hélicase de l’antigène T du virus, il a été montré que la protéine RPA était recrutée par l’antigène T pour stabiliser l’ADN simple brin et le protéger d’éventuels nucléases (Wold and Kelly, 1988). Il a également été montré que la protéine RPA s’associe au complexe de réplication suite à l’initiation du complexe pré- réplicatif par Cdc45, et facilite l’ouverture des deux brins parentaux mais ne possède pas d’activité hélicase. Lors de l’initiation de la réplication, RPA facilite le recrutement, le « switching » et la stabilisation des ADN polymérases, puis stimule leur activité tout au long de l’élongation de la réplication (Binz et al., 2004; Oakley and Patrick, 2010; Yuzhakov et al., 1999).
La protéine RPA est également impliquée dans la reconnaissance des dommages et l’activation du point de contrôle en phase S, elle permet la relocalisation d’ATR au site de dommages et l’activation de Chk1 (Binz et al., 2004).
La phosphorylation de la protéine RPA semble également nécessaire à la recombinaison homologue suite à un stress réplicatif, elle est requise pour le recrutement de la protéine Rad51 et l’initiation du HR après traitement HU (Shi et al., 2010). Elle protège l’ADN après sa résection en évitant la formation de structures secondaires (Chen et al., 2013) et permet, par la suite, le recrutement de la protéine Rad52 par une interaction protéine-protéine qui décroche RPA et facilite le recrutement de Rad51 (Park et al., 1996; Sugiyama and Kowalczykowski, 2002). Enfin, RPA interagit également avec la protéine BRCA2 qui joue un rôle majeur dans la relocalisation de Rad51 au cours de la recombinaison homologue (Liu et al., 2010).
En plus de ses fonctions dans la réplication, la signalisation des dommages et la recombinaison, la protéine RPA est également impliquée dans d’autres mécanismes de réparation (Figure 18), notamment dans la réparation par excision de Nucléotide (NER) où elle intervient dans différentes étapes (Sancar, 1996; Wood, 1997) : elle contribue à la reconnaissance du dommage par son affinité élevée pour le ssDNA et son interaction avec la protéine XPA (He et al., 1995; Stigger et al., 1998), il a été suggéré qu’elle aurait un rôle dans la stabilisation du complexe de réparation et dans la stimulation de l’activité endonucléase du complexe XPF-ERCC1 et enfin, elle coordonne la synthèse post-réparation (Oakley and Patrick, 2010).
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Au cours de la réparation par BER, qui se fait par l’action de glycosylases qui reconnaissent et éliminent le dommage, RPA semble interagir avec l’Uracil-glycosylase. Il a également été montré que la protéine RPA privilégie la voie du « Long Patch » qui constitue une des deux voies du BER, par l’extension d’ADN simple brin, et qu’elle stimule la ligase I, requise pour l’étape finale de réparation par BER. RPA est aussi impliquée dans la réparation par MMR, dans laquelle elle reconnait et protège l’ADN simple brin et stimule l’activité de l’exonucléase lorsqu’un mésappariement est présent (Oakley and Patrick, 2010).
A B
C
D
Figure 18: Les différentes fonctions de la protéine RPA
(A) Dans la réparation par NER RPA reconnait et facilite la réparation. (B) Dans la réparation par recombinaison homologue (C) Dans la réponse aux dommages, elle initie les cascades de signalisation ATR dépendantes et peut également interagir avec p53 et être la cible d’une phosphorylation ATM dépendante. (D) RPA facilite l’initiation et l’élongation de la réplication (d’après (Humphreys, 2010)).
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5.2.1 Régulation de la protéine RPA et impact sur ses différentes fonctions La régulation de la protéine RPA passe par la phosphorylation de sa sous unité RPA2. Ces phosphorylations peuvent être stimulées par plusieurs facteurs : la progression dans le cycle cellulaire, les dommages de l’ADN, l’accumulation de fourches bloquées, ou encore les cassures de l’ADN. L’impact de ces phosphorylations sur les fonctions cellulaires de la protéine RPA n’est pas complètement défini mais plusieurs études ont permis de comprendre certains aspects régulateurs de ces phosphorylations.
A la transition G1/S et en absence de dommages, Cdk2 phosphoryle la protéine RPA sur la sérine 23, l’activation de la kinase Cdk1 au cours de la mitose augmente le niveau de cette phosphorylation, et permet la phosphorylation de la sérine 29 (Anantha et al., 2008; Anantha et al., 2007; Stephan et al., 2009). Dutta et Stillman furent les premiers à montrer cette phosphorylation phase dépendante dans les cellules humaines, suggérant que ces phosphorylations contribueraient à l’initiation de la réplication (Dutta and Stillman, 1992). Cependant les travaux de Fotedar et Roberts montrent que la phosphorylation de la protéine RPA n’est pas nécessaire pour son interaction avec l’ADN simple brin, et que ces phosphorylations seraient probablement requises à la suite de l’initiation du complexe de réplication (Fotedar and Roberts, 1992).
En réponse aux dommages, d’autres sites sont phosphorylés, les travaux d’Anatha et al. ont montré, par l’utilisation de plasmides mutés sur différents sites de la sous unité 2, que la protéine RPA était phosphorylée in vivo de manière séquentielle. En effet, l’interaction de l’hétérotrimère RPA à l’ADN simple brin suite à un traitement à la CPT active ATR qui phosphoryle la sous unité 2 sur la sérine 33
Figure 19) et cette phosphorylation est suivie de la phosphorylation des sérines 23 et 29 par Cdk1 et Cdk2, la mutation de ces deux sites réduisant fortement la phosphorylation ATR dépendante. Ces évènements initiateurs stimulent la phosphorylation du site Thr 21 probablement par la DNA-PK et l’ensemble de ces phosphorylations permet l’hyperphosphorylation de la protéine RPA sur les sérines 4 et 8 qui serait majoritairement DNA-PK dépendante. Cela conduit à une stimulation des protéines RPA adjacentes en trans et leur hyperphosphorylation (Anantha et al., 2007). Plusieurs types de traitements peuvent induire la phosphorylation de ces sites notamment la CPT, l’aphidicoline, le HU, les radiations UV et les RI (Liu and Weaver, 1993; Shao et al., 1999; Zernik-Kobak et al., 1997). De plus l’hyperphosphorylation de la protéine RPA coïncide avec la réparation par RH. En effet, le traitement des cellules en phase G1, S et G2 à la Bléomycine, une drogue induisant des CDB, montre que la forme hyperphosphorylée de la protéine est retrouvée en fin de phase
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S et début de G2, lorsque la RH est maximale, suggérant que l’hyperphosphorylation de la protéine RPA serait un marqueur de résection de l’ADN (Anantha et al., 2007).
Plusieurs études suggèrent que les fonctions de la protéine RPA seraient régulées par cet état d’hyperphosphorylation, cette forme aurait une affinité réduite pour les domaines de réplication. Ce résultat a été démontré in vivo par l’utilisation de plasmides mimant l’état hyperphosphorylé de la protéine dans des cellules humaines, après traitement à la CPT ; de façon intéressante, la protéine RPA hyperphosphorylée ne colocalise plus avec les foyers BrdU mais ne perd pas son affinité pour les foyers d’ADN endommagé, suggérant que l’état hyperphosphorylé de RPA stimulerait sa fonction de réparation (Vassin et al., 2004). En présence d’UV, l’hyperphosphorylation de la protéine RPA a également été associée à l’arrêt du cycle cellulaire et au ralentissement de la réplication (Olson et al., 2006); le mécanisme précis par lequel l’hyperphosphorylation de RPA réduit l’activité réplicative n’est pas défini, une des possibilité serait que son affinité pour les ADN polymérases serait réduite (Binz et al., 2004; Patrick et al., 2005).
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Figure 19: Modèle de la phosphorylation de la protéine RPA en réponse à la CPT et impact en cis et en trans.
La protéine RPA interagit avec l’ADN simple brin formé au cours du dommage, elle est phosphorylée par ATR sur le site S33. Cette phosphorylation sert de substrat pour d’autres modifications de la protéine, par les Cdks sur les sites S29 S23, puis par la kinase DNA-PK sur les sites S4 S8 et Thr21 et probablement sur les sites S11 S12 S13. L’hyperphosphorylation de la protéine RPA agit également en trans sur d’autres molécules RPA (D’après (Anantha et al., 2007)).
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