Les différents mécanismes de réparation des CDBs 1 La résection

Une fois la CDB reconnue, la résection peut être initiée, cette étape consiste en la dégradation d’un des deux bouts francs de la lésion double brin grâce à une activité nucléasique 5’-3’ afin de créer une extrémité ssDNA dont la longueur déterminera le choix du type de réparation (HR versus Alt-NHEJ). Le MRN, BRCA1 et CtIP sont les protéines initiatrices de ce mécanisme. L’interaction CtIP-MRN augmente l’activité nucléasique de Mre11, elle est régulée par la phosphorylation de CtIP par Cdk2 en phase S sur le site S327, qui permet son association avec le complexe MRN mais également avec BRCA1. BRCA1 ubiquitine CtIP qui se relocalise au niveau du dommage, le complexe MRN-CtIP-BRCA1 peut initier la résection via l’activité endo et exonucléasique de Mre11, permettant la formation d’un substrat ssDNA (You and Bailis, 2010). La deuxième étape de la résection consiste en la prise en charge du ssDNA par d’autres enzymes, soit l’exonucléase Exo1, soit l’hélicase BLM et la nucléase DNA2 (Gavel 2008, Nimonkar 2001). La protéine BLM joue un rôle primordial à

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cette étape de la réparation, en effet la résection est l’évènement initiateur de la recombinaison homologue, mais il a récemment été montré que l’accumulation de ssDNA au site de résection pouvait également initier le Alt-NHEJ, qui est un mécanisme « infidèle » et par conséquent source de translocations chromosomiques. L’équipe de Bernard Lopez a mis en évidence l’importance de la protéine BLM dans la maintenance de la stabilité génomique

via la régulation de la réparation par Alt-NHEJ au site de résection (Grabarz et al., 2013) en

montrant que BLM avait deux rôles opposés en fonction de la phase du cycle cellulaire. En G1 et en présence de 53BP1, la protéine BLM réduit la résection CtIP-Mre11 dépendante afin d’éviter le Alt-NHEJ alors que en phase S, et en l’absence de 53BP1, préalablement décroché par BRCA1, BLM facilite la résection afin de promouvoir la réparation par HR (Grabarz et al., 2013). La résection en phase S est également augmentée par l’activité Cdk1 et 2 qui phosphorylent Exo1 sur 4 sites différents (Tomimatsu et al., 2014), initiant la réparation par HR.

4.4.2 La recombinaison homologue

Suite à la résection, le HR se fera en plusieurs étapes : 1) formation des filaments de RPA puis Rad51 sur l’ADN simple brin, 2) recherche d’homologie, formation de la boucle-D, 3) invasion de brin par les ADN polymérases et formation ou non de jonctions de Holliday et 4) résolution des jonctions de Holliday.

La protéine RPA se lie à l’ADN simple brin avec une affinité très élevée, cette étape protège l’ADN de l’action des nucléases et évite la formation de structures secondaires. En effet, l’inhibition de RPA réduit fortement le recrutement de Rad51 et la fréquence de réparation par recombinaison homologue après traitement au HU (Sleeth et al., 2007). Rad52 interagit aussi avec RPA, formant un co-complexe au niveau du ssDNA, qui servira de plateforme au recrutement de Rad51, qui est également facilité par les protéines BRCA1 et BRCA2. La formation du nucléofilament de Rad51 permet la recherche d’homologie de séquence sur la chromatide sœur (Renkawitz et al., 2013), cette invasion du brin endommagé dans les brins de la chromatide sœur est effectué par les polymérases, formant la boucle D (Figure 14) (Sebesta et al., 2013). A cette étape, deux options sont possibles : soit la boucle se dissocie en présence des protéines RTEL ou BLM et se réhybride avec l’ADN complémentaire, la brèche est ensuite comblée et les extrémités religuées, la recombinaison homologue est dite sans échange de brins (Kikuchi et al., 2009; Uringa et al., 2011) ; soit l’invasion de brin forme des jonctions de Holliday (Figure 14), qui peuvent être résolues par le complexe BLM-TOPOIII- RMI1-RMI2 (qui permet la dissolution sans échange de brins) ou par les résolvases SLX1

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SLX4 MUS81 EME1 qui clivent les jonctions avec ou sans échange de brins (Wyatt and West, 2014).

Figure 14: Les étapes de la réparation par recombinaison homologue

(A). La résection permet la formation d’extrémités 3’ sur lesquelles Rad51 formera un nucléofilament, permettant l’invasion des brins par la boucle-D (B). La boucle D peut dissocier sans échange de brin ou évoluer en jonctions de Holliday qui sera résolue en présence des résolvases avec ou sans échange de brins (Daley et al., 2014).

4.4.3 Mécanisme de réparation des CDBs par «Single Strand annealing » (SSA) Un mécanisme alternatif au HR peut réparer les CDBs, le plus souvent dans des contextes Rad51 et BRCA2 mutés, ce processus partage plusieurs effecteurs communs avec le HR (Figure 15). Il est initié par la résection et la formation d’ADN simple brin lié à RPA, la fonction endonucléase 5’3’ du complexe XPF-ERCC1 permet d’éliminer la séquence non homologue des deux brins complémentaires, enfin la religation se fait par la ligase 3 (Liu et al., 2014).

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Figure 15: Mécanismes de réparation des CDBs par « Single Strand Annealing »

La formation d’ADN simple brin se fait en présence de la nucléase Mre11, la longueur de l’ADN simple brin déterminera les protéines intervenant dans le SSA. Dans le cas de longues régions simple brin, RPA et Rad52 sont nécessaire pour faciliter le rapprochement des extrémités, celles-ci seront excisés par ERCC1/XPF, les séquences manquantes seront synthétisées puis liguées, afin de restaurer une séquence répétée complète (d’après (Maggiorella et al., 2003).

4.4.4 La réparation par Jonction d’Extrémités Non Homologues (NHEJ)

La recombinaison par suture non homologue (NHEJ) (Figure 16) est le mécanisme majoritaire de réparation des CDB , il peut avoir lieu tout au long du cycle cellulaire, car contrairement au HR il ne requiert pas d’homologie de séquence, le NHEJ “classique” (C- NHEJ) nécessite le complexe DNA-PK. Ce processus commence par la reconnaissance de la cassure par le complexe senseur Ku (Ku70/Ku80). Cet hétérodimère qui possède une structure en anneau est capable d’entourer l’ADN sur environ deux tours d’hélice. La partie C- terminale de Ku80 possède douze résidus protéiques interagissant directement avec DNA- PKcs (Williams et al., 2014). L’association de DNA-PKcs à l’ADN suffit à son activation, mais son activation est augmentée de façon significative lorsqu’elle est liée au complexe Ku, suggérant que cette interaction est primordiale à l’activation optimale de la protéine (Chiruvella et al., 2013). Ku recrute également le complexe composé de XLF, XRCC4 et Ligase4 (LIG4) qui va permettre la ligation de l’ADN. XLF n’a pas d’activité enzymatique mais permet de stabiliser le complexe XRCC4/LIG4 et d’augmenter son activité par la re- adénylation de la LIG4 suite à la ligation (Ochi et al., 2014). De plus, XLF et XRCC4 forment un filament qui facilite la ligation des brins. Lorsque la structure de l’ADN ne permet pas une

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ligation directe, d’autres protéines facilitant le processing de l’ADN peuvent être recrutées : APLF qui facilite la rétention du complexe XLF/XRCC4/LIG4, Artémis et WRN qui permettent la résection avant la ligation (et dans certains cas l’ouverture de la stucture en forme d’épingle à cheveux), ou encore les PNKP (PolyNucléotides Kinase-Phosphate) et Ku qui ont la capacité d’éliminer les sites abasiques (Liu et al., 2014).

Figure 16: La réparation par jonction non homologue classique (C-NHEJ) et alternatif (Alt-NHEJ)

Le C-NHEJ est initié par l’hétérodimère Ku70/Ku80, le complexe Ku70/Ku80 recrute la kinase DNA-PKcs. En cas de formation de structures secondaires, XLF et Artémis permettent la résection avant religation. L’étape de synthèse se fait en présence des ADN polymérases μ et λ et le complexe XRCC4–LIG4–XLF permet la religation des brins. Dans le cas du Alt- NHEJ, la cassure est reconnue par la PARP-1, le complexe MRN, CtIP et BRCA1 effectuent la résection de l’ADN au niveau de la cassure et l’étape de la ligation se fait par l’association ligase 3/XRCC1 ou par la ligase 1 (D’après (Denis, 2011)).

4.4.5 La réparation par NHEJ alternatif (Alt-NHEJ)

Ce mécanisme est actif tout au long du cycle cellulaire, il partage l’étape de la résection avec le HR. Le travail de Guirouilh-Barbat en 2008 avait permis d’observer une augmentation de la réparation par Alt-NHEJ en phase S (Guirouilh-Barbat et al., 2008). Ces résultats ont été confirmés par les récents travaux de Truong et al. qui montrent que ce mécanisme de réparation peut être actif en présence du HR et du NHEJ, qu’il est augmenté en phase S de

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façon Cdk2 et CtIP dépendante, et qu’il est induit en réponse au stress réplicatif par à un traitement au HU de 24 et 36h (2mM) (Truong et al., 2013).

Ce mécanisme implique les effecteurs PARP-1 et XRCC1/Ligase III (Figure 16). Cette voie s’appuie sur la première étape de la résection (pas plus de 50pb) qui permet l’identification de séquences de micro-homologies allant de 2 à 8 nucléotides (Grabarz et al., 2012). Ces régions s’hybrident et forment une structure intermédiaire. En plus de son rôle dans la reconnaissance du dommage, la PARP-1 est nécessaire à l’accomplissement du Alt-NHEJ par le recrutement de XRCC1 et de la ligase III, qui effectue la ligation des brins (Audebert et al., 2004; Audebert et al., 2006; Liu et al., 2014). Ce mécanisme de réparation est une source majeure de translocations, de ce fait la régulation de la résection au cours du cycle est primordiale pour la stabilité génomique.

4.5 Spécificités de la réparation liée à la fourche de réplication