Souches bactériennes 108

Tableau 11

XI.1.1 Souches corynebactériennes

XI.1.1.1 Conditions et milieux de culture

Les souches de corynébactéries (sauf la souche C. glutamicum ∆otsA∆treY∆treS) sont cultivées dans un milieu liquide BHI (Brain Heart Infusion, Difco) à la concentration de 37 g/L sous agitation à 250 rpm à 30°C, ou sur milieu solide BHI (37 g/L) + agar à 15 g/L à 30°C auxquels peuvent être ajoutés de la kanamycine (Km) à 25 µg/mL ou du chloramphénicol (Cm) à 15 µg/mL.

XI.1.1.2 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 et Res167

Il s’agit de la souche de référence pour Corynebacterium glutamicum. Son génome a été séquencé pour la 1ère fois en 2003 (Kalinowski et al, 2003). Son génome consiste en un seul chromosome circulaire de 3,28 Mpb comprenant 3138 gènes (appelés cgxxxx) et codant pour 3057 protéines.

Une deuxième séquence du génome est disponible de taille comparable (Ikeda & Nakagawa, 2003). Dans ce génome, les gènes sont appelé Ncglxxxx.

La souche utilisée dans ce travail est la souche C. glutamicum Res167 dérivée de la souche de référence (Tauch et al, 2002).

XI.1.1.3 C. glutamicum ΔporA-porH

Cette souche est dérivée de la souche C. glutamicum Res167 par délétion de l’opéron codant pour les protéines PorA et PorH (Costa-Riu et al, 2003a).

L’étude des mutants ponctuels de PorA et PorH s’effectue après complémentation de la souche ΔporA-porH par un plasmide pCGL482 codant pour les protéines :

PorA mutée sur la sérine 15 en valine et PorH native (ΔporA-porH::S15VporA-porH) PorH mutée au niveau des sérines ou des thréonines en alanine et PorA native (ΔporA-

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PorH mutée au niveau des sérines ou des thréonines en alanine et PorA mutée sur la sérine 15 en valine (ΔporA-porH::S15VporA-S/TxxAporH)

L’ensemble de ces souches sont résistantes au chloramphénicol.

XI.1.1.4 C. glutamicum Δpks13::km, ∆fadD32::km, ∆accD4::km

Ces souches sont dérivées de la souche C. glutamicum Res167 par délétion de gènes impliquées dans la biosynthèse des acides mycoliques et qui se caractérisent par l’absence d’acides corynomycoliques et donc de mycomembrane. Ces souches ont un phénotype particulier, sur boîte, les colonies présentent un aspect rugueux, et en culture liquide, des agrégats sont observés.

C. glutamicum Δpks13::km est la souche mutée au niveau de l’enzyme responsable de la

condensation des deux acides gras activés formant l’acide corynomycolique (Portevin et al, 2004).

C. glutamicum ∆fadD32::km est la souche mutée au niveau de l’acyl-AMP ligase permettant

d’activer un des deux acides gras sous forme d’acyl-AMP afin qu’il soit pris en charge par Pks13 (Portevin et al, 2005).

C. glutamicum ∆accD4::km est dépourvu d’une acyl-CoA carboxylase nécessaire à la

formation de l’acyl-carboxy-CoA correspondant au deuxième acide gras activé pris en charge par Pks13 (Portevin et al, 2005).

XI.1.1.5 C. glutamicum ∆otsA∆treY∆treS

La souche ∆otsA∆treY∆treS est une souche dont les 3 voies de biosynthèse du tréhalose sont mutées. Elle se caractérise par l’absence d’acides corynomycoliques en milieu synthétique + saccharose. De même que pour les mutants Δpks13::km, ∆fadD32::km, ∆accD4::km, elle présente un aspect rugueux sur boîte et s’agrège en milieu liquide. Par contre, la synthèse d’acides corynomycoliques peut être réinitiée en la cultivant sur milieu synthétique + saccharose + tréhalose et ceci permet donc de restaurer un phénotype sauvage (Tropis et al, 2005b).

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La souche ∆otsA∆treY∆treS est cultivée en milieu synthétique CGXII à 30°C avec une agitation de 250 rpm (Keilhauer et al, 1993) auquel est ajouté une source de carbone à une concentration de 4% (Tableau 12) (Tropis et al, 2005b).

Source de carbone Croissance Biosynthèse d’acides mycoliques

Saccharose Oui Non

Tréhalose Non Non

Saccharose + Tréhalose Oui Oui

Tableau 12 : Croissance et biosynthèse d’acides mycoliques pour la souche C. glutamicum ∆otsA∆treY∆treS cultivée sur différentes sources de carbone.

XI.1.1.6 Corynebacterium efficiens YS-314

C. efficiens est une souche proche de C. glutamicum. Elle est très utilisée aussi dans

l’industrie pour la production de glutamate. C. efficiens a la capacité de croître et de produire du glutamate au-delà de 40°C, contrairement à C. glutamicum qui est incapable de croître et produire du glutamate à 40°C et au-delà.

Son génome a été séquencé en 2003 et consiste en un chromosome circulaire de 3,1 Mpb comprenant 3008 gènes (noté cexxxx) dont 2938 codant des protéines (Nishio et al, 2003).

XI.1.1.7 Corynebacterium diphtheriae C8r (-) Tox - ATCC 11913

Un seul génome de C. diphtheriae a été séquencé à ce jour : la souche NCTC13129 (Cerdeno- Tarraga et al, 2003). Il s’agit d’une souche pathogène responsable de la diphtérie. Cette maladie est causée par la présence d’un bactériophage produisant une exotoxine : la toxine diphtérique.

Au sein du laboratoire, nous possédons une souche de C. diphtheriae non pathogène du fait de l’absence du bactériophage codant pour la toxine diphtérique appelée C. diphtheriae C8r (-)

Tox – ou C. diphtheriae ATCC 11913 (Barksdale, 1959). Le génome n’est pas connu pour cette souche.

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XI.1.2 Autres souches bactériennes

XI.1.2.1 Rhodococcus erythropolis PR4

Il s’agit d’une bactérie non pathogène découverte dans l’océan pacifique. Cette souche a la caractéristique de dégrader les alcanes en les utilisant comme source de carbone et d’énergie. Son génome consiste en un chromosome circulaire de 6,5 Mpb comprenant 6104 gènes dont 6030 ORFs (Sekine et al, 2006).

Rhodococcus erythropolis PR4 est cultivée dans un milieu liquide LB (Luria Broth base,

Difco) à la concentration de 20 g/L sous agitation à 190 rpm, ou sur milieu solide LB + agar à 15 g/L à 30°C pendant 2 à 3 jours.

XI.1.2.2 Nocardia farcinica IFM10152

Il s’agit d’une souche pathogène de type 2, isolée de poumons d’un homme de 68 ans. Son génome consiste en un chromosome circulaire de 6 Mpb comprenant 5747 gènes dont 5683 ORFs (Ishikawa et al, 2004).

La souche Nocardia farcinica IFM10152 est cultivée sur milieu liquide LB (Luria Broth base, Difco) à la concentration de 20 g/L sous agitation à 190 rpm, ou sur milieu solide LB + agar à 15 g/L à 30°C pendant 2 à 3 jours.

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XI.1.2.3 Gordonia bronchiolis DSM 43247

Il s’agit d’une souche pathogène de type 2, isolée de crachat d’une femme ayant une maladie pulmonaire.

Son génome consiste en un chromosome circulaire de 5.2Mpb comprenant 4922 gènes dont 4616 ORFs.

La souche Gordonia bronchiolis DSM 43247est cultivée sur milieu liquide LB (Luria Broth base, Difco) à la concentration de 20 g/L sous agitation à 190 rpm ou sur milieu solide LB + agar à 15 g/L à 30°C pendant 2 à 3 jours.

XI.1.2.4 Bacillus subtilis ATCC 23857

La souche B. subtilis ATCC 23857 est utilisée dans cette étude comme bactérie témoin des bactéries de type Gram+. Cette souche est cultivée sur milieu liquide riche LB (Luria Broth

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base, Difco) à la concentration de 20 g/L sous agitation à 190 rpm, ou sur milieu solide LB + agar à 15 g/L à 37°C pendant une nuit.

XI.1.2.5 Escherichia coli DH5α

La souche E. coli DH5α est cultivée sur milieu liquide riche LB (Luria Broth base, Difco) à la concentration de 20 g/L sous agitation à 190 rpm à 37°C, ou sur milieu solide LB + agar à 15 g/L à 37°C pendant une nuit.