Impact de l’acylation sur l’activité porine de PorA-PorH 68

La présence d’un acide corynomycolique sur les protéines PorA et PorH a-t-elle une influence sur leur activité porine ? Les protéines PorA et PorH sont décrites comme étant des porines dont l’activité est de 2,5 nS pour un hétérooligomère PorA-PorH (Barth et al, 2010). Toutes les études publiées ont été effectuées à partir de protéines extraites de C. glutamicum ATCC13032 donc possédant un acide corynomycolique. La question qui se pose maintenant est de savoir quel est l’impact de cette modification sur l’activité porine de l’hétérooligomère.

V.2.1 Purification et problèmes rencontrés

Les différentes porines décrites chez les Corynebacterineae sont extraites des bactéries à l’aide de solvants organiques (chloroforme/méthanol), classiquement utilisés pour l’extraction de lipides. Afin de les purifier, les protéines sont ensuite précipitées dans l’éther diéthylique puis séparées par chromatographie échangeuse d’anions comme décrit dans les différentes publications pour PorA et PorH (Costa-Riu et al, 2003a; Hunten et al, 2005a; Lichtinger et al, 2001). Dans le but d’étudier l’activité de chacune de ces protéines et d’évaluer l’importance de la modification post-traductionnelle, nous avons essayé de les séparer. Tout d’abord, nous avons utilisé le protocole de chromatographie échangeuse d’anions décrit, basé sur la présence d’acides aminés acides dans PorA et PorH (Lichtinger et al, 2001). PorA possèdent trois acides aspartiques et deux acides glutamiques et PorH six acides aspartiques et trois acides glutamiques. Les fractions obtenues sont ensuite analysées par gel SDS-PAGE, Western-blot et MALDI-TOF.

L’analyse sur gel et par Western-blot des fractions obtenues fut très laborieuse. En effet, l’analyse sur gel SDS-PAGE a nécessité beaucoup de mises au point du fait du faible masse moléculaire de ces trois protéines (< 10 kDa). Au départ, le protocole « classique » de Laemmli (Laemmli, 1970; Schagger, 2006) a été utilisé pour la séparation des protéines sur un gel à 15% d’acrylamide/bisacrylamide de rapport 37,5/1 avec une migration dans un tampon Tris-Glycine. Ce protocole ne permettait pas d’avoir une séparation correcte des protéines et une bonne reproductibilité dans les zones de faibles masses (Figure 36A). Nous avons opté par la suite pour le protocole de Schägger (Schagger & von Jagow, 1987) mieux adapté aux petites protéines consistant à effectuer une migration dans un tampon Tris-Tricine d’un gel à 16% d’acrylamide/bisacrylamide de rapport 19/1. Le changement du rapport acrylamide/bisacrylamide permet d’obtenir une réticulation plus importante du gel et donc

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d’obtenir une meilleure séparation au niveau des protéines de faible masse moléculaire. L’utilisation de ce protocole a permis d’obtenir des bandes avec une meilleure résolution (Figure 36B). La comparaison des profils des gels entre C. glutamicum ATCC13032 et le mutant ΔporA-porH montre peu différence.

Figure 36 : Gel SDS-PAGE d’un extrait protéique de C. glutamicum sauvage Res167 et du mutant ∆porA-porH A) migration en tampon Tris-Glycine gel 16 % acrylamide/bisacrylamide 37,5:1 B) migration en tampon Tris- Tricine gel 16 % acrylamide/bisacrylamide 19:1

Afin d’identifier clairement la bande correspondant à PorA, PorH et à la protéine X, nous avons effectué un western blot avec des anticorps anti-PorA et anti-PorB (anticorps fournis par l’équipe du Pr. R. Benz). Nous n’observons pas de différence entre l’extrait protéique de

C. glutamicum ATCC13032 et le mutant ΔporA-porH avec l’anticorps anti-PorA (Figure 37).

De plus, nous observons avec ce même anticorps la révélation de plusieurs bandes de plus haute masse moléculaire que PorA dans les deux souches. Nous avons conclu que les anticorps anti-PorA à notre disposition sont non spécifiques et que des réactions croisées avec d’autres protéines sont observées. Ceci a été confirmé par l’étude récente sur l’activité de l’hétérooligomère PorA-PorH (Barth et al, 2010).

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Figure 37 : Western-Blot avec des anticorps anti-PorA et anti-PorB sur des extraits protéiques de C.

glutamicum sauvage (Res167) et du mutant ∆PorA-PorH

Plusieurs tentatives de purification par chromatographie échangeuse d’anions ont été effectuées mais aucune des fractions analysées ne contenait une des trois protéines pures. C’est l’analyse des fractions de purification en MALDI-TOF qui nous a permis de voir que les protéines étaient en mélange.

D’autres tentatives de purification sur différentes phases ont été testées comme en phase inverse C18 par HPLC ou par chromatographie d’exclusion avec une phase spécifique de petites protéines (Sephadex LH-20). Aucune de ces méthodes n’a donné des résultats concluants.

Les efforts de purification de PorA, PorH et la protéine X s’étant révélés infructueux, les études d’activité ont été réalisées sur l’extrait protéique total.

R. Benz et son équipe sont arrivés à la même conclusion mais ces travaux ont été publiés à la fin de mon étude (Barth et al, 2010).

V.2.2 Mesure d’activité par « Black lipid membrane »

Les expériences sur des extraits du mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS montrent qu’il n’y a pas d’activité porine. Est-ce dû à l’absence de mycomembrane ou bien à l’absence de la modification post-traductionnelle ? Une étude de l’activité porine a été effectuée en collaboration avec Alexandre Ghazi (IBBMC, Université ParisXI-Orsay) sur le mutant

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alcalin. L’analyse de l’extrait de C. glutamicum sauvage montre une activité de 3 nS comparable à l’activité publiée dernièrement (Barth et al, 2010). Cette activité est retrouvée lors de l’analyse de l’extrait protéique du mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé en présence de tréhalose, condition permettant de restaurer la mycomembrane (Figure 38A). Comme attendu, ce mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé uniquement sur saccharose ne présente aucune activité porine. De même, l’analyse d’un extrait organique de C. glutamicum sauvage après traitement alcalin qui permet de cliver la modification post-traductionnelle de PorA et PorH montre une absence d’activité (Figure 38B). La modification post-traductionnelle joue donc un rôle prépondérant dans l’activité porine de l’hétérooligomère PorA-PorH mais est-elle nécessaire sur les deux protéines ? La Figure 38C nous montre l’enregistrement obtenu pour le mutant

ΔporA-porH::S15VPorA-PorH dans lequel seul PorH est mycoloylée. Dans cette souche, le

complexe n’a aucune activité dans les conditions testées, ce qui démontre que la mycoloylation sur PorA est indispensable à l’activité porine dans des concentrations protéiques équivalentes à celles des autres souches analysées. Cependant des tests en augmentant la concentration en protéine 5 fois permet de retrouver une activité de 3 nS. Une analyse plus complète est actuellement en cours avec l’équipe du Pr A. Milon à partir de protéines PorA et PorH purifiées de C. glutamicum à l’aide d’une étiquette histidine, constructions obtenues récemment par Barth et al (Barth et al, 2010).

Figure 38 : Analyse de l’activité porine de l’hétérooligomère PorA-PorH en BLM dans des membranes de PC/PS/n-decane A) extrait organique de C. glutamicum sauvage ou du mutantΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé en présence de tréhalose ; B) extrait organique de C. glutamicum sauvage après déacylation alcaline ou du mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé sans tréhalose ; C) extrait organique du mutant ΔporA-porH::S15VPorA-PorH

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En conclusion, nous avons démontré la présence d’une nouvelle modification post- traductionnelle chez C. glutamicum ATCC 13032 que nous avons appelé O-mycoloylation. Cette modification est retrouvée sur deux petites protéines PorA et PorH formant un hétérooligomère ayant une activité porine cation sélective qui est dépendante de la présence l’acide corynomycolique ainsi que sur la protéine X non identifiée jusqu’à nos récents travaux.

L’ensemble de ce travail a donné lieu à une publication dans « Journal biological chemistry » : O-mycoloylated proteins from Corynebacterium: an unprecedented post- translational modification in bacteria (Huc et al, 2010).

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