Analyse du profil lipidique de la souche CGL2059 (cmytC ) 85

Dans les études précédentes, aucune différence au niveau du taux d’acides mycoliques entre les souches sauvage et le mutant cmytC- n’était observée (Brand et al, 2003; De Sousa- D'Auria et al, 2003; Kacem et al, 2004). Nous avons voulu vérifier ces données en effectuant à la fois un dosage, après hydrolyse, des acides corynomycoliques totaux et un dosage spécifique du MMT et DMT.

VII.4.1 Quantification des acides mycoliques

Il est possible de quantifier séparément les acides mycoliques liés au tréhalose (MMT et DMT) et aux protéines (PorA, PorH et protéine X) de ceux liés à l’arabinogalactane. Les premiers sont obtenus après saponification de la fraction dite « lipides extractibles » car facilement extraits par des solvants organiques. Ceux liés à l’arabinogalactane sont obtenus par saponification des bactéries délipidées et sont contenus dans la fraction appelée « lipides liés ».

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Nous avons effectué ce dosage sur les deux clones obtenus pour la souche CGL2059 et sur la souche sauvage (C. glutamicum Res167). Les résultats regroupés dans le Tableau 8 montrent qu’il n’y a pas de différence significative entre les différentes souches ni sur le taux d’acides corynomycoliques liés ni pour les corynomycolates extractibles. Un 2ème dosage sera fait ultérieurement pour confirmer les résultats avec en parallèle la quantification sur la souche complémentée. Ce premier résultat est en accord avec les études précédentes effectuées sur les mycoloyltransférases de C. glutamicum (Brand et al, 2003; De Sousa-D'Auria et al, 2003; Kacem et al, 2004). Acides corynomycoliques liés Acides corynomycoliques extractibles C. glutamicum Res167 1.26% 28.5% CGL2059 clone 1 1.35% 29.9% CGL2059 clone 2 1.39% 30.4%

Tableau 8 : Quantification des acides corynomycoliques liés et extractibles des souches C. glutamicum RES167 et CGL2059.

VII.4.2 Quantification du MMT et du DMT par marquage au [1-14C]-palmitate

Du fait de la faible quantité de certains dérivés du tréhalose (MMT) présents dans les bactéries en phase stationnaire, la quantification a été réalisée par marquage au [1-14C]- palmitate et autoradiographie. Le marquage s’effectue par incorporation de palmitate radiomarqué au cours de la culture bactérienne puis une extraction au chloroforme/méthanol est réalisée sur le culot bactérien. L’analyse se fait par CCM de silice suivie d’une autoradiographie. Grâce au logiciel « µquant », nous pouvons quantifier la radioactivité totale de chaque piste et déterminer le pourcentage relatif de chaque tache sur la piste et ainsi calculer le rapport MMT/DMT (en tenant compte que sur le DMT deux acides corynomycoliques sont marqués). Nous avons quantifié ces composés à la fois sur la souche sauvage et sur le mutant cmytC- en phase exponentielle et en phase stationnaire de croissance. L’analyse de la CCM (Figure 48A) montre une quantité de MMT six fois supérieure pour le mutant cmytC- par rapport à la souche sauvage en phase exponentielle et quatre fois supérieure en phase stationnaire (Figure 49).

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Figure 48 : A) Analyse par CCM du profil des lipides extractibles après marquage au [1-14_{C]-palmitate et}

autoradiographie en phases exponentielle et stationnaire de C. glutamicum sauvage et du mutant cmytC-_{. (solvant} de migration CHCl3/CH3OH/H2O 65:25:4 ) B) Analyse par CCM du profil des lipides extractibles après

marquage au [1-14_{C]-palmitate et autoradiographie en phases exponentielle et stationnaire de C. glutamicum}

sauvage et du mutant cmytC-_{. (Solvant de migration CHCl}

3/CH3OH/H2O 60:35:8 ). Les flèches indiquent les

composés polaires absents dans la souche cmytC-_.

W T e x p c m y tC- e x p W T s ta t c m y tC- s ta t 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 MMT /DM T

Figure 49 : Rapport MMT/DMT après marquage au [1-14_{C]-palmitate en phase exponentielle (exp) et}

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Ce résultat était inattendu dans la mesure où, dans les études précédentes, aucune différence n’avait été reportée au niveau de la quantité de MMT entre un mutant cmytC-

et la souche sauvage (Brand et al, 2003; De Sousa-D'Auria et al, 2003; Kacem et al, 2004).

L’accumulation de MMT observée ici suggère que le MMT pourrait être le substrat utilisée par cMytC pour transférer un acide corynomycolique sur les protéines, comme cela a été décrit pour cMytA vis-à-vis des autres accepteurs (Puech et al, 2000).

La CCM montre également des différences au niveau des lipides les plus polaires. En effet, on observe une radioactivité plus importante pour la souche sauvage au point de dépôt. Nous avons utilisé un solvant de migration plus éluant permettant la migration des composés très polaires (chloroforme/méthanol/eau 60 :35 :8 v/v/v). Dans ce solvant, on remarque la présence de cinq nouvelles bandes dans la souche sauvage qui sont absentes dans le mutant

cmytC-. En plus de l’accumulation du MMT dans le mutant cmytC-, la mutation du gène

cg0413 entraîne la perte du marquage sur cinq autres composés non identifiés (Figure 48B).

Ces composés correspondent-ils à différentes petites protéines modifiées par un acide mycolique et capables de migrer sur CCM ou bien s’agit-il de lipides dont la partie lipidique dépend de la présence de la protéine cMytC ? L’identification de ces composés est en cours au sein de l’équipe. Nous souhaitons maintenant nous pencher sur le mode d’action de la protéine cMytC. Actuellement, nous pouvons émettre deux hypothèses. La première est que l’enzyme cMytC serait impliquée directement dans le transfert de l’acide corynomycolique du MMT sur les protéines. Ceci expliquerait la différence observée par modélisation moléculaire au niveau du deuxième site de fixation du substrat avec une boucle d’insertion permettant des interactions favorables avec les protéines. La deuxième hypothèse est que cMytC serait une enzyme intermédiaire qui transférerait l’acide corynomycolique du MMT sur un autre composé, peut-être de nature lipidique, qui grâce à une nouvelle mycoloyltransférase, permettrait le transfert du corynomycolate sur les protéines.

Pour trancher entre ces hypothèses, nous souhaitons mettre en place un test in vitro de la protéine cMytC. En effet, l’expression et la purification de cette protéine ont été décrits récemment (Bou Raad et al, 2010). Une fois purifiée, la protéine pourrait être mise en présence d’un donneur d’acides mycoliques comme le MMT et d’un extrait protéique contenant PorA, PorH et la protéine X non mycoloylées. Si cMytC transfère directement un acide mycolique du MMT sur les protéines, la réaction pourra être suivie par analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF des protéines mycoloylées.

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