- 46 - M + H+ M + Na+ PorA MENVYEFLGNLDVLSGSGLIGYVFDFLGASSKWAGAVADLIGLLG 4681,39 4703,39 PorH MDLSLLKETLGNYETFGGNIGTALQSIPTLLDSILNFFDNFGDLADTTGENLDNFSS 6162,81 6184,81 Tableau 6 : Masses théoriques de PorA et PorH sous forme d’adduit H+ ou Na+
Figure 22 : Spectre de masse d’un extrait protéique de C. glutamicum ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé en milieu minimum en présence de saccharose, obtenu par MALDI-TOF mode linéaire positif. Tous les ions sont des adduits sodium (M + Na+).
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La présence de la mycomembrane chez les Corynebacterineae est responsable de la faible perméabilité de l’enveloppe, empêchant ainsi la diffusion passive des composés hydrophiles. Pour leur survie, les Corynebacterineae ont mis en place des protéines à activité porine facilitant le passage des solutés hydrophiles à travers cette deuxième membrane composée en particulier d’acides mycoliques.
Une étude des porines chez C. glutamicum a été initiée dans le but de regarder le devenir de certaines protéines pariétales en absence de mycomembrane et d’évaluer l’impact de l’absence d’acide mycolique sur la présence et l’activité des porines. Chez C. glutamicum, il existe différents mutants de la biosynthèse des acides mycoliques comme Δpks13::km (Portevin et al, 2004), ΔfadD32::km et ΔaccD4::km (Portevin et al, 2005) ou bien des voies de biosynthèse du tréhalose, accepteur final et essentiel à la biosynthèse des acides mycoliques (mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS) (Tropis et al, 2005b). Dans un premier temps, l’analyse de la présence des porines a été effectuée dans le mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS. Il a été démontré dans l’équipe que ce mutant cultivé sur milieu synthétique en présence de saccharose, ne synthétise plus d’acides mycoliques. Des expériences de microscopie électronique par cryofracture sur ce mutant montrent un seul plan de fracture au niveau de la membrane plasmique, en accord avec l’absence d’acides mycoliques contrairement à la souche sauvage qui présente un deuxième plan de fracture au niveau de la mycomembrane. L’addition de tréhalose dans le milieu de culture permet de réinitier la biosynthèse des acides mycoliques dans le mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS et donc de former à nouveau la mycomembrane, visible par cryofracture (Tropis et al, 2005b).
Les travaux sur les porines initiés par X. Méniche ont montré que le mutant
ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé en présence de saccharose exprime les porines PorA et PorH
décrites chez C. glutamicum ATCC13032 malgré l’absence de mycomembrane. En effet, l’analyse d’extrait protéique en spectrométrie de masse Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – Time Of Flight (MALDI-TOF) permet de visualiser les protéines PorA et PorH à la masse théorique respectivement sous forme d’adduits sodium [M + Na]+
= 4703Da et 6184Da (Tableau 6, Figure 22). L’expression des porines est donc indépendante de la présence de membrane externe chez C. glutamicum ATCC13032. La question qui s’est posée par la suite était de savoir si les porines exprimées dans des souches dépourvus de mycomembrane conservaient leur activité.
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Figure 23 : Schéma du dispositif de mesure de l’activité porine en bicouche lipidique plane (BLM)
Figure 24 : Etude de l’activité porine de l’hétérooligomère PorA-PorH en BLM dans des membranes de PC/PS/n-decane. A) Extrait protéique de C. glutamicum ATCC13032 ou ΔOtsAΔTreYΔTreS en présence de tréhalose ; B) Extrait protéique de C. glutamicum ΔOtsAΔTreYΔTreS sans tréhalose.
A) B)
3 nS 1 min
3 nS 1 min
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La mesure d’activité des porines s’effectue par la méthode de « black lipid membrane » (BLM) qui consiste à mesurer la conductance entre deux cuves séparées par une bicouche lipidique constituée généralement de diphytanoyl phosphatidylcholine et de diphytanoyl phosphatidylsérine. La formation d’un canal protéique à travers cette bicouche va permettre le passage d’ions d’une cuve à l’autre entraînant ainsi une augmentation de la conductance (Figure 23).
Les premières études en BLM menées sur les protéines purifiées PorA et PorH indiquaient qu’il s’agit de protéines indépendantes ayant chacune une activité porine cation sélective (Costa-Riu et al, 2003a; Hunten et al, 2005a; Lichtinger et al, 1998; Lichtinger et al, 2001). Or, des résultats récents de la même équipe montrent qu’en fait ces deux protéines sont co- traduites et co-purifiées. Les analyses précédentes avaient donc toujours été effectuées sur le mélange des deux protéines. Afin de pallier ces difficultés, les auteurs ont exprimé les protéines PorA et PorH avec une étiquette histidine afin de les purifier séparément. L’activité des protéines recombinantes a été mesurée par des expériences de BLM. Ceci a permis de montrer que l’activité cation sélective de 2,5 nS enregistrée lors des précédentes études est caractéristique de l’hétérooligomère PorA-PorH et non des deux protéines séparées (Barth et
al, 2010). Une étude d’activité des porines a été réalisée, au sein de l’équipe, à partir
d’extraits organiques issus de C. glutamicum Res167, souche qui dérive de la souche ATCC13032, du mutant ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé sur saccharose et du mutant
ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivé en présence de tréhalose afin d’évaluer l’impact de la présence de
la mycomembrane sur l’activité porine de PorA-PorH. La mesure d’activité de l’extrait organique de la souche sauvage permet l’enregistrement de la conductance de référence de 2,5 nS identique à celle publiée. Par contre, l’analyse de l’extrait organique du mutant
ΔOtsAΔTreYΔTreS sur milieu minimum saccharose et donc dépourvu de mycomembrane, ne
montre aucune conductance en BLM ce qui indique que la présence d’acides mycoliques est indispensable à l’activité porine de PorA-PorH. A contrario, la souche ΔOtsAΔTreYΔTreS cultivée sur milieu minimum saccharose en présence de tréhalose présente une activité comparable à celle de la souche sauvage due à la restauration de la mycomembrane (Figure 24).
L’ensemble de ces résultats montre que l’activité porine de l’hétérooligomère PorA-PorH est dépendante de la présence d’acides mycoliques.
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A) B)
Figure 25 : A) Mécanisme de la dégradation d’Edman B) Réaction de β-élimination sur la sérine 15 de PorA dans les conditions du séquençage d’Edman entraînant la formation d’une phénylthiohydantoïne de déhydroalanine.
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Lors de l’identification de PorA par séquençage d’Edman (Figure 25), Lichtinger et al ont mis en évidence la libération d’un dérivé de phénylthiohydantoïne de déhydroalanine à la position 15 à la place d’un dérivé de phénylthiohydantoïne de sérine comme attendu à partir de l’analyse du génome (Lichtinger et al, 2001). Les auteurs ont alors émis l’hypothèse que la sérine 15 était modifiée post-traductionnellement. En effet, la première étape de la dégradation d’Edman se réalise à pH basique afin de permettre le couplage de la fonction amine terminale avec le réactif d’Edman, le phénylisothiocyanate (PITC) (Figure 25A). Les conditions basiques de cette étape entraînent une réaction de β-élimination de la modification post-traductionnelle au niveau de la sérine modifiée et, dans le cas présent, la formation de la déhydroalanine (Figure 25B).
La mise en relation entre les données obtenues sur les mutants dépourvus d’acides mycoliques et la présence potentielle d’une modification post-traductionnelle sur PorA a permis d’émettre l’hypothèse que cette modification était nécessaire à l’activité et était dépendante de la présence d’acides mycoliques.
Mon travail de thèse a consisté à identifier et à caractériser cette modification post- traductionnelle. Cette étude a permis de montrer qu’il existe au moins trois protéines de petite taille chez C. glutamicum ATCC13032 portant cette modification : PorA, PorH et une protéine inconnue au début de l’étude appelée protéine X.
La première partie sera consacrée à l’identification et à la caractérisation biochimique de la modification post-traductionnelle sur PorA, PorH et sur la protéine X par différentes méthodes (spectrométrie de masse, chromatographie en phase gazeuse, dégradations chimiques contrôlées, mutagénèse…) ainsi qu’à l’importance de cette modification en termes d’activité porine du complexe PorA-PorH par des expériences de BLM.
La deuxième partie décrira la démarche ayant permis l’identification de la protéine X jusqu’alors inconnue.
La troisième partie concerne la recherche de l’enzyme impliquée dans le transfert des acides mycoliques sur ces protéines et sa caractérisation.
Enfin dans une dernière partie, nous avons souhaité savoir si ce type de modification est un phénomène spécifique du genre Corynebacterium voire de certaines corynébactéries ou bien s’il s’agit d’une modification générale au sous-ordre des Corynebacterineae.
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