Solution d’agrégats de protéines

Les agrégats de β-lactoglobuline étant générés par dénaturation thermique de la protéine, afin

d’obtenir des agrégats de différentes tailles, la concentration en protéine varie de 1 à 10 g/L.

Or, après traitement thermique, il existe une fraction de protéines non agrégées dans les

solutions d’agrégats. Dans le but d'obtenir des solutions contenant exclusivement les agrégats

de protéines, les solutions ont été purifiées.

III.1.2.1 Purification des agrégats

Les agrégats sont séparées des protéines non agrégées par Ultra Filtration-Centrifugation

(UF-C). La quantité de protéines non agrégées restantes après purification est contrôlée par

chromatographie d’exclusion stérique.

Tableau III.1 : Quantités de protéines non agrégées restantes avant et après l’UF-C en

fonction de la concentration initiale en protéines utilisée lors du traitement thermique.

Le tableau III.1 montre qu’après l'UF-C, il ne reste que 0,5 % de protéines non agrégées dans

la solution la plus concentrée contre environ 1% dans le cas de la solution la moins

Avant UF-C Après UF-C

Concentration initiale en

protéines (g/L) % de protéines non agrégées

1 20.4 ± 10.0 1.0 ± 0.5

2 10.4 ± 2.0 0.80 ± 0.05

8 10.6 ± 2.0 0.80 ± 0.05

concentrée. Les solutions purifiées (ne contenant que des agrégats de protéines) ont ensuite

été caractérisées par diffusion statique et dynamique de la lumière.

III.1.2.2 Détermination de la taille des agrégats par diffusion statique et dynamique de la

lumière

Diffusion statique de la lumière

L'intensité diffusée notée Ir obtenue en diffusion statique en fonction du vecteur de diffusion

q pour des solutions de protéines à différentes concentrations est représentée sur la Figure

III.1.

Figure III.1 : Evolution de l’intensité diffusée normalisée par le produit KC en fonction du

vecteur de diffusion pour des solutions de protéines non agrégées et d’agrégats de protéines

obtenues à partir de différentes concentrations initiales en protéine.

L'extrapolation de ces courbes à faible q permet d'accéder à la masse molaire des agrégats

formés notée M

_w

: La valeur s'étend de 1.10

⁷

g.mol

^-1

pour les plus petits agrégats à 2.10

⁸

g.mol

^-1

pour les plus larges. Il est alors possible d'estimer le nombre de monomères de

protéine non agrégée présents dans les agrégats. Les plus petits agrégats sont constitués d'une

centaine de monomères tandis que les plus larges en contiennent plusieurs milliers. Comme le

montre la Figure III.1, la masse molaire des agrégats augmente avec la concentration initiale

avant chauffage.

En normalisant l’intensité diffusée I

r

par la masse molaire obtenue et en la représentant en

fonction du produit q.R

gz

, une courbe maîtresse peut être obtenue pour toutes les solutions de

protéines non agrégées et d'agrégats de protéines (Figure III.2). Aux grandes valeurs de q.R

gz

,

1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09 0.001 0.01 0.1 q (nm-1) I/ K C ( g .m o l -1) ^{blg non agrégée} 2 g/l 4 g/l 8 g/l 10 g/l 14 g/l

nous observons une dépendance en loi de puissance du type I

_r

(q) ∞ q

^-df

. Dans notre cas, la

dimension fractale df est proche de 2 ce qui correspond à une df typique des agrégats fractals

de β-lg [5, 102].

0.001 0.01 0.1 1 10 0.001 0.01 0.1 1 10 100 q.Rgz Ir (q )/ m^w Pente - 2.0 ±0.2

Figure III.2 : Courbe maîtresse du vecteur de diffusion normalisé en fonction de l’intensité

diffusée normalisée.

La Figure III.3 montre une photographie de Cryo-Microscopie Electronique à Transmission

représentant des agrégats de β-lactoglobuline obtenus à pH 7 et à 0,1 M NaCl. Cela nous a

permis de vérifier par microscopie l’aspect des agrégats de protéines. Les agrégats ont un

aspect de brins courbés, ce qui a été classiquement observé dans la littérature [102, 139].

Figure III.3 : Cliché de Cryo-Microscopie Electronique à Transmission d’agrégats de β

-lactoglobuline formés à pH 7 0,1 M NaCl à partir d’une solution de protéines de concentration

de 5 g/L.

Diffusion dynamique de la lumière

Les mesures en diffusion dynamique nous ont permis de déterminer la distribution en taille

des agrégats de protéines représentée sur la Figure III.4. A partir d'une solution de protéines

non agrégées dont la concentration initiale a été fixée à 1 g/L, les agrégats obtenus par

traitement thermique ont un rayon hydrodynamique moyen de 35 nm. Si la concentration de la

solution initiale de protéine non agrégée est plus élevée et fixée à 10 g/L, les agrégats de

protéines formés ont une rayon hydrodynamique moyen de 197 nm.

Figure III.4 : Distribution en taille de la β-lg non agrégée et des agrégats de protéines obtenue

en diffusion dynamique de la lumière.

Afin de couvrir une gamme relativement étendue, quatre tailles d'agrégats ont été choisies

pour notre étude :

-R

_h

= 35 nm constituant les plus petits agrégats,

-R

h

= 71 nm et R

h

= 117 nm constituant les agrégats de taille intermédiaire,

-R

_h

= 197 nm étant les agrégats les plus larges.

Dans la suite du manuscrit, les agrégats étudiés seront notés avec leur rayon hydrodynamique

moyen noté R

h

.

Nous remarquons sur la Figure III.4 que les distributions en taille des agrégats de protéines

sont relativement larges. La largeur à mi-hauteur des distributions est de 9,7 nm dans le cas

des protéines non agrégées, 89 nm pour les agrégats avec un R

h

de 35 nm et 811 nm pour les

plus larges agrégats avec un R

h

de 197 nm. Ces largeurs de distribution implique l’existence

0 2 4 6 8 10 12 14 1 10 100 1000 10000

Diam ètre hydrodynam ique (nm )

In te n s it é ( % ) blg non ag agrégats Rh 35 nm agrégats Rh 71 nm agrégats Rh 117 nm agrégats Rh 197 nm

de fractions d’agrégats de différentes tailles au sein d’une distribution en taille donnée

d’agrégats.

En résumé, les caractéristiques de la β-lg non agrégée et des agrégats de protéines sont

regroupées dans le Tableau III.2 suivant :

Tableau III.2 : Caractéristiques de la β-lg non agrégée et des agrégats de protéines (quantité

de protéines non agrégées restantes avant et après l’UF-C, rayon hydrodynamique R

h

, rayon

de giration R

g

et masse des agrégats M

w

) en fonction de la concentration initiale en protéines.

Il est important de noter que malgré la purification, une très faible quantité de protéines non

agrégées est présente dans les solutions d’agrégats. Cette fraction est de l’ordre de 0,5 - 1 %

selon la taille des agrégats générés. Elle ne sera pas à négliger dans la discussion et

notamment lors de la détermination des propriétés interfaciales. En effet, dans le domaine des

interfaces, une faible proportion de molécules présentant une activité de surface suffit à

affecter les propriétés.

Dans la suite du manuscrit, les agrégats de protéines exempts de protéines non agrégées

seront appelés agrégats de protéines.

R

_h

(nm) R

_g

(nm) M

_w

(g.mol

^-1

)

β-lg non agrégée 3,0 ± 0,8 2,5 ± 0,5 3,3.10

⁴

Avant UF-C Après UF-C

Concentration

initiale en

protéines (g/L)

% de protéines

non agrégées ^R

^h

^(nm)

% de protéines

non agrégées _R

h

(nm) R

g

(nm) M

w

(g.mol

^-1

)

1 20,4 ± 10,0 34 ± 6 1,0 ± 0,5 35 ± 1 26 ± 2 3.10

⁶

2 10,4 ± 2,0 66 ± 1 0,80 ± 0,05 71 ± 1 52 ± 2 1.10

⁷

8 10,6 ± 2,0 111 ± 1 0,80 ± 0,05 117 ± 1 105 ± 5 7.10

⁷

10 3,7 ± 0,6 196 ± 5 0,50 ± 0,05 197 ± 10 185 ± 5 2.10

⁸

Dans le document Rôle des agrégats de protéines dans la formation et la stabilisation de mousses (Page 73-78)