Discussion concernant le rôle des agrégats de protéines en présence de protéines

Nous avons montré que la présence d’agrégats de protéines pouvait améliorer les propriétés

moussantes d’une protéine. Nos résultats montrent que les agrégats seuls ne sont pas capables

d’augmenter les propriétés moussantes (cf. III.2.4) mais participent à une meilleure

stabilisation des mousses en présence de protéines non agrégées. L’étude des mélanges de

protéines non agrégées et d’agrégats a permis de mettre en évidence l’importance de deux

paramètres-clés: la taille et la quantité d’agrégats.

Quelque que soit le mode de formation de l’interface (adsorption ou dépôt), les propriétés

interfaciales sont affectées par la taille et la quantité d’agrégats. Contrairement aux solutions

contenant exclusivement une espèce, dans le cas des mélanges, des phénomènes de

compétition entre les deux espèces peuvent se produire. Cela provient de leur différence de

taille et de mobilité induisant des propriétés interfaciales différentes (cf. paragraphe III.2.2).

En effet, dans le cas des expériences par adsorption, nous avons montré que les larges

agrégats de protéines ne sont pas capables de s’adsorber aux interfaces, contrairement aux

agrégats de plus petite taille.

La taille des agrégats influe fortement sur les propriétés des mélanges :

Si les agrégats sont de petite taille ayant un R

h

de 35 nm, les phénomènes de compétition

existants avec les protéines non agrégées présentes dans le mélange sont peu marqués. Les

deux espèces peuvent s’adsorber à l’interface eau/air.

Si les agrégats sont de taille importante ayant un R

h

de 197 nm, les phénomènes de

compétition avec les protéines non agrégées sont nettement plus marqués du fait de la grande

différence de taille et de propriétés aux interfaces. Dans ce cas, les protéines non agrégées qui

diffusent plus rapidement s’adsorbent préférentiellement à l’interface eau/air. Les larges

agrégats de protéines peuvent venir ensuite interagir avec les protéines non agrégées

adsorbées dans les couches interfaciales. La Figure III.65 représente schématiquement ces

deux types d’adsorption.

a) b)

Figure III.65.a) Représentation schématique des protéines non agrégées et des agrégats de

protéines ; b) Représentation schématique des couches adsorbées formées par les mélanges de

protéines non agrégées et d’agrégats de protéines selon leur taille.

Que le film de protéines soit formé par adsorption de molécules à l’interface eau/air ou par

dépôt d’une solution à l’interface, les phénomènes de compétition existent toujours. En mode

dépôt, la protéine non agrégée s’étale mieux à l’interface que les agrégats. C’est elle qui va

donc régir les propriétés interfaciales du film. Les propriétés d’étalement des agrégats

dépendent de leur taille. Nous avons montré à l’aide des mesures de spectroscopie infrarouge

IRRAS (cf. paragraphe III.2.2.4) que les petits agrégats avec un R

_h

de 35 nm semblaient se

déplier à l’interface eau/air. Lorsque leur taille augmente, les agrégats s’étalent moins. Le

dépliement des agrégats à l’interface doit probablement être limité par la présence des ponts

disulfures S-S. Ces interactions covalentes fortes stabilisent les agrégats, leur conférant une

forte cohésion. En effet, dans notre cas, les agrégats sont obtenus dans des conditions

statiques (24h à 80°C), laissant le temps aux ponts disulfures de se former, contrairement aux

agrégats formés dans des conditions dynamiques (temps de chauffage bref et hautes

températures 100 ou 120°C) qui sont stabilisés par des liaisons faibles, leur donnant une faible

cohésion [139].

Le ratio protéines non agrégée/agrégats joue également fortement sur les propriétés

interfaciales et moussantes des mélanges. Dans les mélanges contenant de faibles proportions

d’agrégats, les propriétés interfaciales sont régies par la protéine non agrégée. Dans ce cas,

nous avons montré que le temps de latence des molécules du mélange est réduit, accélérant la

diminution de la tension de surface et la stabilisation de l’interface. Dans les mélanges

contenant de fortes proportions d’agrégats, la quantité de protéines non agrégées présentes

Protéines non agrégées Petits agrégats de protéines (Rh ~ 35nm)

Larges agrégats de protéines (Rh~200 nm) avec une distribution en taille relativement large (cf. Figure III.4) Eau Air Eau Air Eau Air Eau Air Eau Air Eau Air

devient trop faible pour pouvoir couvrir l’interface et la stabiliser efficacement. Dans ce cas,

l’effet des agrégats sur les propriétés interfaciales est davantage marqué, et ce d’autant plus

que leur taille augmente, diminuant la stabilisation de l’interface.

Il existe donc une quantité critique de protéines non agrégées nécessaire dans un mélange

pour former et stabiliser les interfaces efficacement et ainsi obtenir des propriétés moussantes

et interfaciales supérieures à celles des protéines non agrégées. Les propriétés des mélanges

de protéines non agrégées et d’agrégats sont qualifiées de supérieures si trois critères sont

vérifiés : i) Le volume de mousse à 1200s après la fin du bullage est supérieur à celui de la

mousse de protéines non agrégées, ii) la résistance à la pression est plus élevée que celle des

films de protéines non agrégées et iii) les films sont stables plus longtemps à une pression

donnée.

Figure III.66 : Quantités de protéines non agrégées nécessaires à la formation de mousses et

de films interfaciaux stables en fonction de la taille des agrégats.

Comme le montre la Figure III.66, la quantité de protéines non agrégées nécessaire pour

améliorer les propriétés moussantes et interfaciales des mélanges est dépendante de la taille

des agrégats. Plus la taille des agrégats augmente, plus cette quantité est forte : 2% de

protéines non agrégées sont nécessaires pour former des mousses stables à partir des petits

agrégats ayant un R

h

de 35 nm contre 10% dans le cas des larges agrégats ayant un

R

h

de 197 nm. Au niveau des films interfaciaux, la quantité de protéines non agrégées

nécessaire pour former des films qui résistent à des pressions plus élevées et qui sont plus

stables avec le temps pour une pression donnée varie de 4% pour les petits agrégats avec un

R

h

de 35 nm à 10% pour les plus larges avec un R

h

de 197 nm. Les valeurs obtenues dans le

0.1 1 10 100

0 50 100 150 200 250

Rayon hydrodynam ique des agrégats (nm )

% d e p ro té in e s n o n a g ré g é e s n é c e s s a ir e p o u r o b te n ir d e s p ro p ri é té s m o u s s a n te s e t in te rf a c ia le s s u p é ri e u re s à c e ll e s d e s p ro té in e s n o n a g ré g é e s

cas des mousses cas des films interfaciaux

cas des mousses et des films interfaciaux sont proches. La légère différence que nous pouvons

cependant observer entre ces deux échelles témoigne de la difficulté de comparer les systèmes

modèles avec ceux réels. Le films interfacial isolé est un système unique, tandis que la

mousse à l’échelle macroscopique est composée d’une multitude de films isolés qui peuvent

être horizontaux, verticaux ou obliques. Quand un film se rompt dans la mousse, les films

adjacents en sont affectés et doivent se réarranger. Cette différence peut rendre difficile les

comparaisons avec un unique film isolé horizontal.

Ainsi, il existe des conditions, dépendantes de la taille des agrégats et du ratio protéines non

agrégées/agrégats, pour lesquelles les mousses formées sont plus stables que celles de

protéines non agrégées. Au vu de l’ensemble des résultats obtenus aux différentes échelles de

la mousse, deux mécanismes coexistants de stabilisation des mousses par les agrégats de

protéines peuvent être proposés :

D’une part, les agrégats en présence de protéines non agrégées peuvent former des

couches viscoélastiques dans les films entre les bulles d’air pouvant conduire à la formation

d’un réseau de type gel et ainsi contribuer à la stabilisation des mousses. La formation de ce

réseau peut également se produire dans la phase continue entre les protéines non agrégées et

les agrégats, adsorbés ou non. Ce type de mécanisme a déjà été montré par Saint-Jalmes et al.

[41] dans le cas d’agrégats de caséine, par Schmitt et al. [4] pour les agrégats de lactosérum,

et par Horozov pour des nanoparticules [35]. Selon ces auteurs, la formation d’un réseau de

type gel semble être le mécanisme de stabilisation le plus efficace car le réseau peut garder les

bulles bien séparées, limitant ainsi la coalescence et le drainage de la mousse.

D’autre part, en raison de la taille des agrégats et de leur manque de propriétés

interfaciales comparées à celles de la protéines non agrégées, il est raisonnable de proposer

que les larges agrégats de protéines peuvent rester dans la phase liquide. Les agrégats de

protéines sont alors piégés dans le réseau de nœuds et de bords de Plateau que constitue la

mousse. Dans ce cas, les agrégats peuvent jouer le rôle de bouchon dans la stabilisation des

mousses. Ce type de mécanisme a déjà été observé pour des mousses stabilisées par des

nanoparticules non adsorbées [15, 17, 27, 36, 154]. Dans le cas des plus petits agrégats, le

confinement peut également être envisagé dans les films interfaciaux.

Nous discutons ci-après les résultats qui ont conduit à la formulation de ces deux types de

mécanismes.

1. Hypothèse de formation d’un réseau de type-gel

Lorsque les mousses formées sont instables, les films interfaciaux isolés correspondants

montrent la présence de larges structures mobiles à la surface du film avec le temps et la

pression appliquée sur le film. Dans ce cas, les protéines non agrégées sont présentes mais en

quantité non suffisante, et même si les larges agrégats de protéines peuvent s’assembler entre

eux et former de plus larges structures, il n’y a pas suffisamment de protéines non agrégées à

la surface pour immobiliser les structures formées et stabiliser efficacement le film.

Lorsque les mousses formées sont stables, les films interfaciaux isolés correspondants

présentent un comportement fortement viscoélastique : lorsque nous augmentons la pression,

la périphérie du film est immédiatement affectée alors que le centre du film garde l’aspect

qu’il avait avant l’augmentation de pression. Nous observons également de larges structures

connectées entre elles et immobiles en fonction du temps et de la pression appliquée sur le

film. Dans ce cas, les protéines non agrégées sont présentes en quantité suffisante, les

agrégats peuvent venir interagir avec les protéines non agrégées adsorbées à l’interface qui,

comme elles sont dénaturées et dépliées, peuvent offrir de nombreux sites d’interactions. Les

protéines non agrégées peuvent alors jouer le rôle de points d’ancrage à l’interface. Nous

pouvons également penser que outre les protéines non agrégées, les agrégats de petite taille

présents dans les mélanges (cf. la distribution en taille des agrégats de protéines sur la

Figure III.4) peuvent également servir de points d’ancrage, étant donné que ces petits

agrégats sont capables de s’adsorber aux interfaces (cf. Figure III.7). Ces assemblages

d’agrégats immobilisés à la surface du film peuvent interagir entre eux et se connecter les uns

aux autres pour couvrir la totalité du film. Le phénomène d’agrégation en surface peut alors

conduire à la formation d’un réseau de type gel, connu pour stabiliser efficacement les

mousses [4, 41, 44, 152].

Dans le cas où aucune large structure n’est observée, du fait de la limite de résolution de la

balance à films (de l’ordre du micron), les films présentent tout de même des caractéristiques

de couches viscoélastiques à la surface du film. Non seulement les anneaux concentriques

mais également le dimple au centre du film qui reste centrosymétrique pendant le drainage du

film peuvent être attribués à la présence d’interfaces élastiques. Le dimple est une poche de

fluide épaisse formée au centre du film et entourée d’une zone d’épaisseur plus faible,

généralement appelée barrière circulaire schématisé sur la Figure III.67 [152].

Figure III.67 : Représentation d'un film formant un dimple en vue de profil [152].

Le drainage du dimple influence considérablement la stabilité du film. En effet, la manière

dont le dimple se résorbe pour aboutir à la formation d’un film homogène dépend de la

rhéologie des interfaces eau/air qui constituent le film. Si, après la formation du film, le

dimple migre rapidement (de l’ordre de quelques secondes) vers la périphérie du film, le

drainage est appelé asymétrique et indique que les interfaces sont fluides. Ce processus

conduit à des films instables qui se rompent rapidement. En revanche, si le dimple reste

centrosymétrique pendant le drainage du film et disparaît très lentement (en quelques dizaines

de minutes), le drainage est dit alors symétrique. Dans ce cas, le dimple est stabilisé par des

interfaces rigides qui présentent de fortes propriétés viscoélastiques.

La formation du réseau de type gel est également confirmée à l’échelle de l’interface. Les

résultats obtenus au tensiomètre à goutte montrent une augmentation du module dilatationnel

des couches adsorbées en présence d’agrégats de protéines. Les couches adsorbées

viscoélastiques formées par les mélanges protéines non agrégées/ agrégats de protéines

doivent être stabilisées par des fortes interactions protéine-protéine (liaisons hydrophobe,

hydrogène et électrostatique). Ces résultats rappellent ceux obtenus par Zhu et Damodaran

[133] sur des couches adsorbées formées par des agrégats de protéines de lactosérum. La

présence d’agrégats renforce donc la viscoélasticité des couches adsorbées à l’interface

eau/air, augmentant la stabilité des mousses faites à partir de ces mélanges. De façon générale,

le lien entre stabilité des mousses et augmentation de la viscoélasticité des couches adsorbées

est vérifié.

La formation du réseau de type gel dans le film va jouer sur le drainage, que ce soit au niveau

des films interfaciaux qu’au niveau de la mousse 3-D. Durant le drainage, le fluide contenu

dans le film s'écoule de façon radiale depuis le centre du film vers les bords de Plateau. La

vitesse de drainage des films peut être estimée en assimilant ce problème hydrodynamique au

problème d'écoulement d'un fluide contenu entre deux plaques circulaires de rayon R,

parallèles, immobiles, distantes d'une épaisseur h et se rapprochant avec une vitesse v. Dans

ce cas simplifié, l'expression de la vitesse de drainage s'écrit :

P

R

h

dt

dh

v=− = ∆

²

3

3

η

où η est la viscosité du liquide et ∆P la différence de pression appliquée sur les surfaces du

film. En pratique, la cinétique de drainage est plus rapide que celle prévue par l'expression

ci-dessus car les interfaces sont considérées comme des plaques rigides et indéformables. Or, les

interfaces sont déformables, le fluide peut alors s'écouler plus rapidement et l'écoulement peut

être contrôlé par la rhéologie des interfaces. Cette formule montre cependant l'importance de

la viscosité du liquide sur la vitesse de drainage : le drainage est d’autant plus ralenti que la

viscosité du liquide est grande [26].

Nous avons appliqué cette relation sur nos films stables de mélanges de protéines non

agrégées et d’agrégats de protéines en considérant à deux temps donnés les épaisseurs

estimées via la technique d’interférométrie. La différence d’épaisseurs obtenue pendant

l’intervalle de temps nous permet d’accéder à la vitesse de drainage du film et ainsi d’en

déduire la viscosité des films. Elle a été estimée à environ 80 mPa.s pour des films de

protéines non agrégées et à environ 200 mPa.s pour des films de mélange d’agrégats et de

protéines non agrégées pour lesquels on suppose la formation d’un réseau de type gel (par

exemple, cas des mélanges contenant 90% d’agrégats avec un R

_h

de 197 nm). Cette valeur est

environ deux fois supérieure à celle obtenue dans le cas des films de protéines non agrégées.

Il est largement admis que le drainage lent est dû à la formation de couches visco-élastiques à

la surface du film [65-66]. La tendance trouvée est ainsi cohérente avec la formation d’un

réseau de type-gel.

De plus, au niveau de la mousse 3-D, le drainage est d’autant plus ralenti que la taille des

agrégats est importante (cf. paragraphe III.4.1.3). La formation d’un réseau de type-gel joue

sur la viscosité des interfaces au niveau des bords de Plateau et ainsi sur leur mobilité. Selon

la nature de l’interface, qu’elle soit mobile ou rigide, le drainage de la mousse est fortement

affecté [23, 28]. Si l’interface est rigide, la répartition des vitesses dans un bord de Plateau

adopte un profil type Poiseuille, schématisé Figure III.68a. L’ essentiel de la résistance à

l’écoulement se concentre donc dans les bords de Plateau. Si l’interface est mobile, il y a une

contribution des nœuds. Dans ce cas, le profil des vitesses dans les bords de Plateau passe

d’un profil type Poiseuille à un profil type « bouchon » (cf. Figure III.68b)

Figure III.68 : Ecoulement de type a) Poiseuille (interface rigide) et b) bouchon (interface

mobile).

Dans notre étude sur le drainage libre des mousses contenant 90% d’agrégats de protéines,

aux temps longs, le régime d’écoulement peut être déterminé par une loi de puissance définie

comme ε = t

^-β

. La valeur de l’exposant β dépend de la mobilité de surface des bords de

Plateau. Selon cette valeur, les bords de Plateau sont plus ou moins mobiles. Cervantès-

Martinez et al. [23] distingue deux cas : Pour 1 ≤β≤ 2, les surfaces des bords de Plateau sont

considérées comme mobiles (écoulement de type bouchon). C’est le cas de la mousse de

protéines non agrégées puisque la valeur est égale à 1,1. Pour β≤ 1, les surfaces des bords de

Plateau peuvent être considérées comme immobiles ou encore rigides (écoulement de type

Poiseuille). Ce second cas est observé pour des mousses issues de mélanges contenant 90 %

d’agrégats de protéines où la valeur est de 0,6. Cela indique qu’en présence d’agrégats, les

bords de Plateau présentent une mobilité réduite, retardant ainsi le drainage et menant à des

mousses plus stables.

Le réseau de type gel peut se former à la fois dans les films interfaciaux et dans la phase

continue. Nous avons vu que les agrégats et les protéines non agrégées s’assemblaient aux

interfaces eau/air en structures de quelques microns qui pouvaient se connecter entre elles.

Les protéines non agrégées adsorbées au niveau des bords de Plateau peuvent servir de points

d’ancrage aux agrégats qui s’assemblent entre eux pour former de larges structures. Ces

dernières peuvent interagir entre elles et se connecter les unes aux autres. Elles pourraient

ainsi remplir les cavités de la mousse que sont les bords de Plateau et les nœuds, et les

stabiliser.

2. Hypothèse des agrégats piégés dans les bords de Plateau

Les résultats de drainage libre (cf. Figure III.33) et forcé (cf. Figure III.35) ont montré un

ralentissement de l’écoulement du liquide à travers les mousses générées à partir de mélanges

contenant une faible quantité d’agrégats. Même l’écoulement du liquide à travers une mousse

contenant 1% de large agrégat est ralenti comparé à celui réalisé à travers une mousse de

protéines non agrégées. Le piégeage des agrégats dans les bords de Plateau et leur

confinement dans les films interfaciaux pourrait être à l’origine de la stabilité des mousses et

des films générés à partir des mélanges contenant une faible quantité d’agrégats.

L’observation des films interfaciaux fait apparaître des domaines de faible épaisseur indiqués

en noir, comparé au reste du film qui apparaît en gris avec la présence de structures à la

surface du film. En raison de leur plus faible épaisseur, ces domaines peuvent contenir

seulement des protéines non agrégées. Les domaines noirs sont résistants au changement de

pression puisque leurs positions et leurs tailles restent inchangés avec l’augmentation de la

pression. Les agrégats confinés dans le film et situés en périphérie de ces domaines peuvent

alors les stabiliser par encombrement stérique. Le confinement des agrégats peut empêcher les

domaines de devenir plus fins, ralentissant le drainage des films. Ce mécanisme confère au

film une grande rigidité comparée à celle des films de protéines non agrégées, ce qui

expliquerait la forte résistance aux changements de pression que nous observons.

La formation de couches viscoélastiques a été observée dans les films isolés, via la formation

d’un dimple, ou d’anneaux concentriques, tout deux restant centrosymétriques au cours du

drainage du film. Ces films sont très résistants aux changement de pression, et ce quelque soit

la taille des agrégats. Les mousses correspondantes sont elles aussi plus stables que celles de

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