La signalisation calcique dans les CMLV

Le calcium des CMLV peut provenir des réserves intracellulaires ou du milieu extracellulaire. Il est bien documenté que la libération du calcium des réserves intracellulaires des CMLV est principalement opérée par deux types de canaux-récepteurs de calcium : les récepteurs sensibles à la ryanodine (RyR) et le récepteur sensible au 1, 4,5 Inositol triphosphate (IP3R) (Santulli G. et coll., 2017) (Reddish FN. et coll., 2017) (Johny JP. et coll., 2017). Pour suivre la libération du calcium par ces recepteurs, nous avons utilisé le Fluo-4 AM, un indicateur fluorescent spécifique du calcium. Après avoir pénétré dans les CMLV, l'intensité de la fluorescence émise par le Fluo-4, visualisée par microscope à épifluorescence, sera dépendante de la concentration du calcium dans le cytosol de la CMLV.

Dans de telles études, la caféine, qui est un agoniste connu pour activer les RyR, est utilisée pour déclencher la libération de calcium des réserves intracellulaires (Sugimachi S. et coll., 2016) (Malgaroli A. et coll., 1990). Nous avons testé les effets de 5 différentes concentrations de caféine : 1, 2, 5, 10 et 20 mM et nous avons retenu pour les expériences ultérieures la dose de 10mM qui permet une libération maximale du calcium intracellulaire des CMLV prélevées dans tous les groupes de rats.

Nos résultats sont représentés comme le rapport de ΔF / F0, avec : (ΔF) = Δ fluorescence = FMax - F0;

F0 : est l'intensité basale de fluorescence enregistrée avant l’ajout des 10 mM de caféine.

Cette méthodologie de calcul de normalisation, validée par Maravall (Maravall M. et coll., 2000), représente l'amplitude du signal pour une condition donnée et calcule sa variation en éliminant les différences entre les niveaux de fluorescence basaux de chaque cellule.

Nous avons aussi mené une série d'expériences afin de vérifier dans quelle mesure les canaux récepteurs RyR et IP3R sont impliqués respectivement dans la réponse calcique observée. Pour ce faire, nous avons utilisé des antagonistes spécifiques de ces récepteurs :

1- le dantrolène (10 μM) : antagoniste spécifique des RyR : il agit sur RyR1 et RyR3 : (Zhao F. et coll., 2001) (Keshavarz M. et coll., 2016) (Liou B. et coll., 2016).

2- la xestospongine C (10 μM) : antagoniste spécifique de l’IP3R (Saleem H. et coll., 2014) (Oka T. et coll., 2002).

Les analyses de nos résultats par des tests ANOVA à deux facteurs (HI et EI) sans mesures répétées montrent que l’HI induit une augmentation globale des flux de calcium libérée du RS (p = 0,007), chez les rats sédentaires aussi bien que chez les rats entraînés, après stimulation des cellules par 10 mM de caféine (Fig. 49 A). De même l’EI augmente globalement la libération de calcium du RS (p = 0,042), chez les rats normoxiques et hypoxiques (Fig. 49 A). Il est à noter que les effets de l’HI et de l’EI sont indépendants l'uns de l'autre (interaction non-significative HI x EI : p = 0,841).

Lorsque les CMLV sont pré-incubées avec le dantrolène (inhibant l’action des isoformes RyR1 et RyR3) et après leur stimulation par 10 mM de la caféine, une libération de calcium est toujours enregistrée (Fig. 49 B). Ceci révèle que l’isoforme RyR2, non-inhibée par le dantrolène joue un rôle important dans la libération de calcium intracellulaire. De plus, nous remarquons que la quantité de calcium libérée après stimulation par la caféine, au niveau des cellules pré-incubées avec le dantrolène, est inférieure à celle qui est libérée par les cellules non-traitées par le dantrolène (Fig. 49 A et B). Cette diminution de la quantité de calcium est d’ordre de 40% dans le groupe N, de 33% dans le groupe IH, de 22% dans le groupe NIT et de 26% dans le groupe IHIT (test Anova 1 facteur) (Fig. 49 A et B). Ceci révèle que les isoformes RyR1 et RyR3 participent aussi à cette libération de calcium du RS. En outre, dans les CMLV pré-incubées avec la dantrolène, l’EI exerce toujours son effet significatif global (p = 0,0345) en augmentant la quantité de calcium libérée aussi bien chez les rats hypoxiques que chez les

normoxiques (Fig. 49 B). L’HI ne montre cependant plus d'effet significatif, mais seulement une tendance à élever la quantité de calcium libérée (p = 0,0888).

Finalement, nous avons utilisé la xestospongine C, pour vérifier si l’IP3R participe aussi à la libération de calcium induite par la caféine. En comparant les résultats obtenus avec (Fig. 49 A) et sans (Fig. 49 C) pré-incubation avec la xestospongine C, nous constatons que la quantité de calcium libérée est réduite par la xestospongine C chez tous les groupes de rats avec un pourcentage de 20% chez les rats N, de 38% chez les rats IH, de 42% chez les rats NIT et de 35% chez les rats IHIT (test Anova 1 facteur). Ceci a lieu en absence de tout effet de l’HI (p = 0,657) et de l’EI (p = 0,7166) (Fig. 49 A et C). La quantité de calcium ainsi libérée (Fig. 49 C) correspond à la part de calcium non-libérée par les IP3R. Ceci indique donc que l’IP3R participe aussi à la libération du calcium intracellulaire du RS induite par la caféine.

Figure 49 : Amplitude de la réponse calcique des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) à 10 mM de caféine, sans pré-incubation (A), pré-incubées avec 10 μM de dantrolène (B) ou pré-incubées avec 10 μM xestospongine (C), observées par microscopie à épifluorescence après incubation cellulaire avec le Fluo-4 AM. N : rats en normoxie, IH : rats soumis à l’hypoxie intermittente soumis ou non à l’entraînement physique intensif. Un effet significatif global de l'hypoxie intermittente (rats sédentaires et entraînés ensemble) est représenté sur le graphique par ** pour p ≤ 0,01. Un effet significatif global de l'entraînement intensif (rats hypoxiques et

Interprétation- hypothèse :

Nos résultats de l’imagerie calcique, montrent que l’HI et l’EI induisent une augmentation de la libération du calcium du réticulum sarcoplasmique des cellules musculaires lisses vasculaires des l’aorte des rats. Ces changements peuvent expliquer en partie l’effet de l’EI sur la réactivité vasculaire, et en partie l’effet de l’HI sur la pression artérielle des rats. Les changements des taux du calcium intracellulaire enregistrés sont probablement associés à une suractivation des canaux calciques, soit à une surexpression de ces canaux. Nous avons testé dans la suite la possibilité de l’effet de l’HI et de l’EI sur l’expression des canaux, récepteurs et pompes calciques par Q-PCR.