Seuillage de l'image corrigée

Nous voulons pouvoir appliquer un seuil à nos images an de considérer comme particule tout élément supérieur au seuil. Or ces images possèdent un fond additif variable dont la valeur dépasse parfois celle des uorophores les moins excités. De plus, le fond n'est pas constant et nous pouvons considérer qu'il est soumis à des uctuations gaussiennes d'amplitude propor- tionnelle à la racine carrée de l'intensité lumineuse. Nous souhaitons d'une part avoir le même niveau de uctuations sur l'image entière et d'autre part retrancher le fond pour pouvoir placer un seuil au dessus des uctuations.

Nous estimons les uctuations comme étant proportionnelles à la racine carrée de l'intensité d'excitation. Nous considérons que l'excitation est proportionnelle à Fml[D(x, y)], nous renor-

mons donc une image initiale en la divisant par pFml[D(x, y)]. Cette méthode d'estimation

du fond donne en eet un résultat proche de l'intensité lumineuse moyenne contrairement à Frb[D(x, y)]qui, en suivant les minima, s'approche de cette intensité moins les uctuations. De

plus, Fml[D(x, y)] n'est jamais nul ce qui est moins certain pour Frb[D(x, y)]. Une éventuelle

division par zéro n'est alors pas à craindre. Cela nous mène à l'image 3.5 A où l'on voit que si les écart-types sont uniformisés, il reste un fond moyen local (dont la valeur moyenne doit être la racine du précédent fond) qui s'ajoute aux intensités du centre de l'image. Le fait d'avoir des uctuations comparables sur l'ensemble de l'image permettra de xer un seuil situé bien au dessus de l'écart-type des variations d'intensité du bruit. Avant d'appliquer le seuillage, il faut supprimer le fond additif restant.

A C

B D

Figure 3.5  Représentations 2D (A) et 3D (B) d'une image dont la variance du bruit de fond a été uniformisée à l'aide des valeurs obtenues à la gure 3.3 A (moyenne locale du fond). Représentation 2D (C) et 3D (D) de l'image précédente après traitement du type rolling-ball. Le fond moyen est retranché, il ne reste alors plus que les uctuations du fond rendues homogènes à l'étape précédente ainsi que les uorophores. En particulier, le milieu de l'image n'est pas plus élevé que les bords. Les représentations A et C sont en couleurs inversées par rapport à l'image originale (gure 3.2).

Nous avons après cette étape des données D1(x, y)en cours de traitement :

D1(x, y) =

D(x, y) pFml[D(x, y)]

(3.4) Pour ôter le fond restant et porter la moyenne locale du bruit à une valeur identique sur toute l'image, nous appliquons le traitement de type rolling-ball et obtenons Frb[D1(x, y)].

Comme nous l'avons vu sur la gure 3.3 A, notre traitement par convolution fait une moyenne sur une zone de 49 pixels et traite le fond moins nement que le traitement par rolling-ball où l'on peut choisir un motif de rayon 2 pixels seulement. Nous retranchons donc à D1(x, y)

3.2 Détection des particules 61 son fond Frb[D1(x, y)]. Le résultat est montré sur l'image 3.5 C. Nous avons alors des données

traitées D2(x, y) : D2(x, y) = D1(x, y) − Frb[D1(x, y)] (3.5) D2(x, y) = D(x, y) pFml[D(x, y)] − Frb[ D(x, y) pFml[D(x, y)] ] (3.6)

À ce niveau, un seuillage global sur l'image est possible. Les gures 3.5 B et D sont une autre représentation des gures A et C où l'on se rend mieux compte de la modication eec- tuée entre les deux images.

Une fois ces opérations eectuées, on peut dénir un seuil au delà duquel on considère qu'un uorophore est présent. L'image 3.6 représente en noir les pixels dont la valeur dépasse le seuil. Le seuil a été choisi relativement bas pour pouvoir repérer la majorité des uorophores.

Figure 3.6  Image 3.2 après traitement et seuillage. Les particules sont quasiment toutes détectées grâce à un seuil relativement bas mais cela fait apparaître quelques faux positifs.

Le fait de choisir un seuil bas permet de ne pas rater trop de uorophores mais sur les 262 144pixels de l'image soumis à un bruit poissonnien, certains peuvent dépasser le seuil sans uorophore associé. On peut avoir typiquement entre 100 et 1000 points correspondant à des faux positifs (dépendant du seuil choisi)2_{. Nous avons en moyenne environ 500 faux positifs}

par image, ce qui fait par pixel une chance sur 500 de donner un faux positif, .

2. Nous appelons faux positif un point détecté là où en réalité il n'y a rien. Un faux négatif sera un uorophore présent à la surface mais non détecté par le programme.

Pour s'aranchir de ce problème, on compare cette image avec une autre de la même zone prise quelques instants après. Comme nous travaillons généralement avec des lms, il sut de comparer les deux premières images de la série. Ne sont conservés que les pixels dépassant le seuil sur les deux images. Les uorophores xés sur la lamelle se retrouveront sur les mêmes pixels dans les deux images et seront conservés. On a vu qu'un pixel avait statistiquement de l'ordre d'une chance sur 500 de donner un faux positif à cause de la variabilité du bruit de fond. Il y a alors pour un pixel une chance sur 5002 _{de donner un faux positif sur deux}

images consécutives. Vu le nombre de pixels d'une image, on se retrouve avec un nombre de faux positifs de l'ordre de l'unité sur toute l'image, ce qui est négligeable et ne perturbera pas les mesures statistiques eectuées sur les uorophores. L'image 3.7 montre les pixels conservés après comparaison de deux images diérentes de la même distribution de uorophores.

Figure 3.7  La comparaison entre les deux premières images d'une séquence d'acquisition après seuillage (ici l'image 3.6 et l'image suivante du lm dont elle est extraite) permet d'éli- miner la grande majorité des faux positifs.