Instants de disparition des uorophores retenus

Une fois ce tri eectué entre les trois comportements possibles (présents jusqu'à la n, disparition en cours d'expérience, comportement non-canonique), nous en retirons l'information que l'on cherche sur les instants de départs. Les uorophores de la seconde population se font attribuer l'instant de départ estimé lors du tri. Il s'agit de l'image à laquelle la trace temporelle passe d'un palier haut à un palier bas.

Nous comptons les uorophores de la première population car ils représentent la proportion de uorophores toujours présents en n de lm. Le fait que tous les uorophores n'aient pas disparu à la n du lm est une source d'information. Les uorophores ne s'éteignent pas tous par photoblanchiment car celui-ci suit une loi exponentielle. Il doit donc logiquement rester des uorophores présents en n de séquence, leur nombre dépendant de l'ecacité de traduction (taux de uorophores hybridés à un ARNm complexé à un ribosome fois le taux de ribosomes

actifs). À photoblanchiment égal, plus la traduction est ecace moins il reste de uorophores en n d'expérience.

Enn, ceux n'ayant pas un comportement canonique ne sont pas pris en compte ni pour l'instant de départ, ni dans le nombre total de uorophores étudiés. Ce nombre total est obtenu en additionnant les uorophores des deux premières populations.

La gure 3.14 montre quelques traces de particules avec les instants de départ estimés par le programme. Sur cette gure, nous voyons la trace temporelle d'une particule de haut en bas. Les marqueurs rouges représentent les instants de départ estimés par notre programme pour chaque particule. Ces marqueurs sont placés avant la première image pour les uorophores de la troisième population. Nous avons utilisé ce type de gure pour vérier l'ecacité du programme et déterminer les valeurs nales des seuils utilisés.

Figure 3.14  Traces temporelles de 51 particules sur une séquence de 100 images. L'intensité de chaque particule est codée en niveaux de gris. Les marqueurs rouges montrent les instants de départs tels que déterminés par le programme. Ces marqueurs sont en −1 pour des uorophores éliminés en raison de leurs comportements non-canoniques. Ils sont placés à l'image 100 pour des uorophores toujours présents en n de lm.

Si nous sommes dans l'ensemble satisfaits de l'estimation du programme, nous notons qu'il subsiste quelques points au sujet desquels nous pourrions être en désaccord. En particulier les particules 26 et 43 ont été classées comme non-canoniques alors que l'instant de départ ne semble pas ambigu. Cette tendance à considérer comme non-canoniques quelques particules normales peut modier légèrement le taux de traduction en augmentant articiellement le nombre de points présents jusqu'à la n du lm par rapport aux points disparaissant de façon standard. Cependant, l'information principale que nous recherchons est le temps caractéristique d'élongation et nous n'avons pas repéré de biais concernant ce temps : la probabilité d'erreur de traitement ne dépend pas de l'instant de disparition de la particule.

3.4 Conclusion 73

3.4 Conclusion

Nous avons mis au point un programme permettant de détecter des uorophores sur une image et de suivre leur présence sur une séquence d'images. Ce suivi est indépendant du ratio signal sur bruit des uorophores, ce qui permet de comparer les uorophores situés dans des régions plus ou moins excitées de la zone d'observation.

Nous avons également adapté le programme à l'étude comparée de deux séries d'images d'une même zone observée à deux longueurs d'onde diérentes. Pour chaque système rapporteur équipé des deux marqueurs uorescents, nous pouvons obtenir l'intervalle de temps entre les départs des deux uorophores.

Ce programme est adapté aux données obtenues lors de nos expériences de TIRF et peut être rapidement modié pour s'adapter à des niveaux de bruit de fond ou d'intensité du signal diérents.

C H A P I T R E 4

Résultats expérimentaux sur la

cinétique de traduction en molécule

unique

Nous avons suivi, pendant la traduction, le signal de uorescence des oligonucléotides mar- qués de nos systèmes rapporteurs. Nous cherchons la signature de la traduction d'un ribosome unique, à savoir la disparition de notre champ d'observation d'oligos marqués, détachés par le passage d'un ribosome unique à un endroit précis de l'ARNm.

Dans un premier temps, nous comparerons les instants de départ respectifs des deux oligos diérents situés sur le trajet du ribosome. Un écart temporel systématique nous permettra de déterminer une vitesse d'élongation in vitro pour des ribosomes de mammifères.

Dans un second temps, nous étudierons la distribution des instants de départ de chacun des oligos marqués à partir de l'injection des extraits cellulaires marquant le début de la traduction. La présence d'un temps caractéristique lent nous prouvera que l'initiation non-canonique du ri- bosome utilisée dans nos expériences ralentit fortement le premier cycle d'élongation. La vitesse des autres cycles d'élongation conrmera la valeur de la vitesse mesurée lors de l'expérience avec deux oligos marqués.

4.1 Passage du ribosome eucaryote entre deux instants de la

phase d'élongation

Dans cette partie, nous étudions la traduction eucaryote en plaçant deux oligos uorescents sur l'ARN messager. Ces oligos sont munis d'un ATTO 647N (noté oligo 4r et dit rouge) pour le premier et d'un ATTO 565 (noté oligo 13v et dit vert) pour le second et font oce de jalons comme montré à la gure 4.1. Comme on l'a vu au chapitre 2, ces deux oligos sont de courtes séquences d'ARN qui ont été choisies de façon à avoir une température de fusion la plus proche possible (même nombre de nucléotides et même taux de C et G), de l'ordre de 40C. L'oligo 4r est identique et est placé à la même distance du site P du ribosome que l'oligo H12 utilisé dans les expériences de Takyar et al. [10] étudiant l'activité hélicase du ribosome procaryote. Cela nous permet de supposer que l'oligo 4r partira comme l'oligo H12 après 4 cycles d'élongation.

Figure 4.1  Principe de l'expérience : le ribosome placé sur l'IRES commencera à tra- duire avec l'arrivée des extraits cellulaires. Ce faisant, il détachera successivement les oligo- uorophores rouge puis vert de l'ARNm. N'étant plus reliés à la surface, ces derniers sortiront de la zone d'observation par diusion.

Le ribosome est initialement positionné sur un IRES comme nous l'avons vu à la section 2.7.2. Le premier jalon quitte l'ARNm lorsque le ribosome a eectué quatre translocations et le second neuf translocations plus tard soit treize translocations après le début de la traduction (gure 4.2). Il devrait alors être possible de déterminer l'intervalle de temps entre le passage du ribosome à ces deux endroits précis de l'ARNm. Cela permettra d'obtenir des informations sur la vitesse de traduction locale à 31C, qu'il s'agisse de simples cycles d'élongation comme ici ou, à l'avenir, du passage de séquences particulières.

Figure 4.2  Position du ribosome et des oligos hybridés sur l'ARNm. Après 4 translocations, à l'équilibre thermodynamique (oligos similaires à ceux utilisés dans [10]), l'oligo 4r s'est détaché de l'ARNm puis après 9 autres translocations, l'oligo 13v s'en va à son tour.

Notons que pour déterminer précisément le nombre de translocations nécessaires pour déta- cher le premier oligo, il faudrait prendre en compte les diérences de conditions expérimentales entre notre expérience et celle de Takyar et al. [10] :

 Notre ribosome eucaryote est plus gros qu'un procaryote, on peut donc penser que le site hélicase, qu'il situe à +11 nucléotides du site P, sera un peu plus éloigné pour l'eucaryote. Au maximum, on peut le positionner à la limite de l'empreinte du ribosome eucaryote

4.1 Passage du ribosome eucaryote entre deux instants de la phase d'élongation 77 sur l'ARNm, estimée à +15 nucléotides. Ceci impliquerait donc qu'il pourrait sure de

3 translocations pour décrocher l'oligo dans le cas de l'eucaryote.

 Notre température de travail est de 31C au lieu de 37C pour les expériences de Takyar et al., ce qui conduit à une meilleure stabilité de l'oligo hybridé. En utilisant les formules données à la section 2.6.1, on trouve qu'il faut décrocher 4 nucléotides à 31C au lieu de 3 à 37C pour que 80 % des oligos soient détachés.

Les deux eets étant opposés, il est raisonnable de considérer que 4 translocations restent nécessaires pour décrocher le premier oligo, en gardant à l'esprit que 3 translocations pourraient sure.

Pour les expériences décrites dans cette section, seul compte l'écart de 9 nucléotides entre les deux oligos et le fait que leur stabilité est la même : ils se détacheront pour le même nombre de bases désappariées par le ribosome. En revanche, pour les expériences de la deuxième partie du chapitre, nous pourrons avoir une incertitude sur le nombre exact de translocations nécessaires au départ de l'oligo 4r. Nous y reviendrons lors de l'analyse de ces expériences.