Accroche spécique aux lamelles de microscope

Nous avons vu que l'excitation par onde évanescente permettait d'observer les uorophores situés à l'interface verre/eau. Si nous souhaitons voir des traductions sur une surface, nous devons pouvoir attacher des systèmes biologiques à cette surface.

Tout d'abord, la surface doit être propre de toute particule uorescente. Pour ce faire, les lamelles sont placées dans un portoir en verre et lavées aux ultrasons dans un bain d'acétone pendant 25 minutes, puis deux fois dans un bain d'eau ultra-pure pendant 25 minutes. Une fois sèches, elles sont soumises à un plasma d'oxygène (de 0, 4 mbar) pendant dix minutes. Nous conservons les lamelles ainsi nettoyées sous une hotte à ux laminaire de classe 100.

Une particule quelconque peut venir se xer sur une surface de façon dite non-spécique. La liaison n'est pas particulièrement stable et la particule ne reste en place que quelques instants. Pour observer une réaction biologique au cours du temps, ce type d'accroche n'est pas adapté. Dans notre cas, nous souhaitons avoir des systèmes biologiques accrochés de façon stable. La première étape consiste donc à passiver la lamelle de verre. Il s'agit de recouvrir le verre de molécules électriquement neutres au pH de l'expérience. Nous avons choisi de passiver nos surfaces à l'aide de polyéthylène-glycol (PEG). Les PEG utilisés possèdent une fonction silane à une extrémité : il s'agit d'un hydrure de silice qui crée aisément des liaisons avec le silicate (verre).

2.5 Accroche spécique aux lamelles de microscope 39

Figure 2.8  Cycle d'acquisition d'images pour un lm de traduction. Les diérents éléments sont commandés à l'aide d'un séquenceur permettant une synchronisation à la microseconde près. Nous présentons le cas où nous observons des uorophores de deux couleurs diérentes. Dans le cas où on observerait un seul uorophore, la roue à ltre resterait constamment sur la même position et on n'eectuerait qu'une seule acquisition d'image par cycle. La caméra est réglée pour faire l'acquisition d'une séquence d'images de 200 ms chacune (100 ms sont parfois susantes si le ratio signal sur bruit et assez élevé). La roue à ltre dispose de 600 ms pour passer d'une position à une autre, il est possible d'être plus rapide mais il y a alors un risque de dérégler la roue. Le laser rouge est piloté par commande analogique, le laser vert reste allumé (pour assurer son rôle parallèle dans le système de maintien de focus automatique) et n'est bloqué que par un obturateur mécanique dont le temps de réponse est de quelques millisecondes. Un compromis entre les cinétiques de traduction et de photoblanchiment nous fait prendre une image dans chaque couleur toutes les cinq secondes, mais il est possible de prendre jusqu'à quatre images par seconde dans une couleur ou à l'opposé de patienter jusqu'à trente secondes entre deux images.

utilisons le couple biotine-streptavidine bien connu ayant une faible constante de dissociation (de l'ordre de 10−15 _mol.L−1_{). Nous utilisons la Neutravidine(Invitrogen, Molecular Probes)}

qui possède la même constante de dissociation avec la biotine ainsi qu'un potentiel isoélectrique presque neutre (6, 3). La Neutravidinepossède quatre sites d'accroche pour les biotines ce qui lui permet de faire le lien entre une surface et des ARNm biotinylés.

Pour assurer la présence de biotines à la surface, nous ne passivons pas uniquement avec du PEG-silane mais aussi avec du biotine-PEG-silane. Le PEG-silane (Methoxy-Poly (Ethylene Glycol)-Silane, 5000 g.mol−1_{, Laysan Bio, gure 2.9) est conservé en poudre à −80 C. Le}

2.10) est conservé à −80C, dilué à 200 g.L−1 _{dans du méthanol. Nous diluons 20 mg de PEG-}

silane et 1 mg de biotine-PEG-silane dans un tampon d'acide borique (100 mM) à pH 8, 8 avant d'injecter sur une surface préalablement activée par un plasma d'oxygène6 _{(ce plasma}

renettoiera par la même occasion les surfaces de verre). Nous mettons le PEG en excès par rapport au PEG-biotine pour limiter le nombre d'accroches disponibles à la surface. Le nombre de systèmes biologiques eectivement accrochés dépendra également de leur concentration lors de leur injection et du temps d'incubation avant rinçage.

Le silane s'hydrolyse en phase aqueuse et cette réaction est fortement dépendante du pH [42]. La vitesse de réaction du silane avec la surface de silice dépendra également du pH. La nature et le pH du tampon ont donc été optimisés empiriquement.

Figure 2.9  Structure du PEG sans biotine terminé par une fonction silane.

Figure 2.10  Structure du PEG-biotine terminé par une fonction silane.

Après passivation par le PEG avec incubation de une à deux heures, la surface est rincée avec le tampon d'acide borique et reste au repos une nuit entière. Ce temps de repos est empirique, nous supposons que les surfaces perdent leurs charges résiduelles car la quantité d'accroches non-spéciques diminue avec le temps. Le lendemain, nous rinçons avec une solution de BSA (Bovine Serum Albumin) à 10 g.L−1 _{dans un tampon TRIS pH 7, 5 (100 mM 2−Amino−2−}

hydroxymethyl − propane − 1, 3 − diol) salé (250 mM NaCl) que nous laissons incuber une à deux heures. Nous rinçons avec le tampon TRIS salé puis, avant utilisation sur le microscope, nous injectons la Neutravidine(100 mg.L−1 _{dans TRIS salé) pendant cinq à dix minutes. Après}

rinçage par un tampon adapté aux ribosomes, la cellule sur laquelle est xée la lamelle est prête à recevoir des systèmes biologiques munis de biotines et à être placée sur le microscope.

6. Après ce passage dans un plasma d'oxygène, nous intégrons les lamelles aux cellules microuidiques. L'injection et le rinçage des diérents éléments passivants se fait dans le canal des cellules.