Critère de choix des paramètres de détection

Nous avions pour objectif de pouvoir compter des particules sur une surface. Ces particules peuvent être très visibles ou estompées jusqu'à être indétectables. Le but est de pouvoir détecter automatiquement le plus grand nombre de particules possible. En eet, l'un des avantages de la microscopie TIRF est de pouvoir observer plusieurs événements en parallèle. Cela nous est utile car nous souhaitons obtenir des informations de nature statistique ce qui nécessite un grand nombre de mesures. Nous cherchons donc à ne pas passer à côté d'événements présents dans nos données par insusance du traitement de ces données.

Cependant, il ne s'agit pas de détecter trop de particules. Si l'÷il et le cerveau humain sont ecaces pour détecter les contrastes, il est tout de même possible pour un programme d'être encore plus performant. Nous n'avons pas souhaité dépasser les capacités humaines pour

3.2 Détection des particules 55 pouvoir vérier rapidement les résultats obtenus par le programme. En eet, dans le cas d'un tel

programme, développé pour les besoins spéciques de cette expérience, nous sommes amenés à eectuer certaines modications au cours du temps.

Tout d'abord, ce programme a fréquemment été amélioré. Au début de ces trois années de thèse, le laser bleu était le laser principal et délivrait un faisceau dont le prol d'intensité était quasiment gaussien. L'estimation du fond se faisait alors par une interpolation gaussienne de l'intensité lumineuse mesurée par la caméra. Avec l'achat de nouveaux lasers et l'utilisation plus fréquente de la diode laser rouge, cette partie du programme a dû être modiée. En eet, le prol d'intensité du faisceau rouge est trop éloigné d'une gaussienne pour que cette méthode d'estimation du fond soit pertinente. Au cours de la première année de thèse, nous avons testé une méthode de suppression du fond par transformée de Fourier et élimination des basses fréquences. Malgré quelques oscillations parasites, cette méthode donnait d'assez bons résultats et a été utilisée pendant plusieurs mois. La comparaison ultérieure avec d'autres méthodes de ltrage plus ecaces nous a fait modier cette procédure. Ces deux exemples illustrent l'évolution du programme au cours des trois dernières années. De nombreuses autres modications plus ou moins importantes ont été apportées mais nous nous contenterons ici de détailler la dernière version en date.

D'autre part, nous avons de temps à autre modié les conditions de l'expérience. Nous avons par exemple testé diérents uorophores (nanocristaux semi-conducteurs, cyanines, bodipy-FL, Alexa, ATTO) dont certains possèdent des propriétés photophysiques relativement éloignées. Nous avons également modié l'intensité d'excitation et le temps d'intégration lors de l'acqui- sition d'une image ainsi que l'angle d'incidence du faisceau en réexion totale. Ces variations ont mené à des images diérentes sur les niveaux d'intensité, de bruit ou de contraste. Il était alors souhaitable de modier les paramètres du programme et en particulier les niveaux de seuillage. Il est possible de modier d'autres paramètres tels la taille maximale des particules ou la taille de la zone d'observation.

Nous voyons donc que le programme de traitement des images est modié ce qui nécessite de pouvoir vérier son ecacité. Pour cela, nous comparons la position des points détectés avec les images brutes et les instants des disparitions avec les séquences d'images. Pour la détection des points, nous pouvons compter manuellement le nombre de uorophores sur une image. Plus simplement, nous pouvons superposer l'image brute et les points détectés, cela permet de repérer facilement les points où l'on n'est pas satisfait du programme.

Si l'image brute et les particules détectées ne correspondent pas, nous retouchons les pa- ramètres car le programme n'est manifestement pas ecace. Si au contraire nous validons les résultats du programme sur une image, nous vérions sa stabilité en le testant sur d'autres images. Nous choisissons généralement des images présentant soit de nombreux uorophores soit très peu an de vérier que le programme est insensible au nombre de particules à traiter. Cependant, notre programme de détection peut, avec un seuil bas, détecter plus de uo-

rophores que l'÷il d'un doctorant. Le programme peut être capable de placer des points dans les zones faiblement excitées là où l'on ne voit que du bruit. Faire une moyenne d'intensité sur plusieurs images consécutives d'une même zone permet d'augmenter le ratio signal sur bruit. Les points suggérés par le programme deviennent alors visibles. Comme nous souhaitons eec- tuer des vérications sur plusieurs images, nous avons besoin de pouvoir vérier rapidement la validité des points détectés en repartant des images brutes. Nous imposons donc un seuil assez haut au programme lors de la détection des particules de sorte à avoir la même ecacité de détection que l'÷il humain. Cela permet en outre de conserver une marge par rapport au niveau de bruit.

D'autre part, nous verrons par la suite qu'il faudra détecter les instants de départs des particules ce qui est plus aisé lorsque les particules en question sont bien visibles (d'intensité bien supérieure au bruit de fond local). L'étape de détection doit donc être assez sévère pour ne considérer que les particules ayant un ratio signal sur bruit raisonnable.

La détection de particules se fait par seuillage de l'image, l'idée intuitive étant que seules les particules brillantes dépassent un certain seuil de signal. Cependant, nous avons vu que toutes n'ont pas la même intensité. De plus, l'intensité moyenne du fond est importante au centre de l'image et peut rivaliser avec l'intensité des particules sur les bords. Pourtant ces dernières sont bien visibles car situées dans une zone où l'intensité moyenne est faible et le contraste est susant. Nous cherchons donc à prendre en compte un fond variable sur l'image.